论文部分内容阅读
HIN1(Harpin-induced gene 1)基因是受Harpins蛋白和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)所诱导过程中表达的一种抗性基因,它与拟南芥抗性基因NDR(Nonrace-specific disease resistance gene)具有相似的基因序列,所以统称为NHL(NDR1/H1N1-Like)家族。该家族的基因在多种植物防卫反应、生长发育、衰老以及抗逆过程中都发挥着重要功能,目前关于植物抗性基因HIN1的研究大多集中在对于真菌或者细菌的抗性研究,对植物病毒的抑制作用及其作用机理方面的研究仍十分少见,并且明确该基因在抗烟草花叶病毒的功能对于防治病毒病有重要的理论和实际意义。本研究通过分子克隆技术从本氏烟中分离得到HIN1基因,通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;明确烟草NbHIN1的亚细胞定位情况和组织表达水平,并成功构建了植物表达载体pFGC5941-NbHIN1,通过遗传转化方法得到了超表达NbHIN1的本氏烟草,并在此基础上进行了抗烟草花叶病毒的功能鉴定,最后通过转录组测序,探求其抗病毒作用机理。结果表明本氏烟NbHIN1开放阅读框687bp(KU195817),进化树结果表明茄科植物之间亲缘关系最近,拟南芥次之,与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远。蛋白预测结果表明NbHIN1编码229个氨基酸,蛋白的理论分子量为26.2kD,具有保守结构域LEA-14。激光共聚焦显微镜下观察到融合RFP的NbHIN1定位在细胞膜上。NbHIN1基因在开花期的本氏烟草各个组织中均有表达,且相对表达量由高到低依次为根>花>叶>茎。利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,获得阳性遗传转化植株,它在形态学上和野生型并没有明显的差异,也并未出现过敏性坏死斑点。通过摩擦接种TMV-GFP后,在第2天就出现了肉眼可见的绿色荧光斑点,相比之下对照组的斑点数多于处理组。接种后第3天斑点开始变大并开始扩散,第4天时对照组已经扩展到整片心叶而处理组则还未扩展到心叶,处理组的绿色荧光斑点也相对较少,通过荧光定量PCR检测TMV含量也间接证明病毒RNA水平的积累量显著低于对照组。通过比较野生型和遗传转化植株的转录组数据,发现了102条差异表达的基因,其中48条上调、54条下调。它们参与了植物体内多种的生理生化过程,包括植物与病原菌的互作、植物激素信号转导、内吞作用、RNA降解等多达23个不同的通路。通过实时荧光定量PCR的验证后我们发现烟草PARN、CNGCs、RAB11基因在处理组和对照组均上调表达,经过茉莉酸处理之后,本氏烟中HIN1和RAB11分别在5h和2h开始上调,在5～12h两个基因的响应趋势是基本一致的。但是蛋白互作的试验证明NbRAB11和Nb1IN1之间并没有存在直接的互作关系,它们之间具体的关系还需要进一步研究。