【摘 要】
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目的 动物整体水平和体外细胞水平,应用差异蛋白组学技术,筛查鉴定及验证脉络丛(CP)中锰毒性差异表达的关键蛋白,并在细胞水平进一步揭示抑制素蛋白(PHB1)在锰所致CP上皮
【机 构】
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北京市疾病预防控制中心/北京市预防医学研究中心 北京市食物中毒诊断溯源技术重点实验室,北京100013
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目的 动物整体水平和体外细胞水平,应用差异蛋白组学技术,筛查鉴定及验证脉络丛(CP)中锰毒性差异表达的关键蛋白,并在细胞水平进一步揭示抑制素蛋白(PHB1)在锰所致CP上皮细胞周期阻滞效应中的调控作用机制.通过本研究将从脉络丛这个新视点为锰神经毒性作用的分子机制理论增加新的认识,为锰中毒的早期防治提供新的思路.方法 (1)锰中毒大鼠模型的建立 雄性SD大鼠随机分为6个实验组,30 d染毒组与对照组,90 d染毒组与对照组,90 d染毒+30 d恢复期与对照组.染毒组腹腔注射MnCl2,6 mg· kg-1·d-1,对照组予以生理盐水.(2)透射电镜等验证模型中锰对CP的病理损伤.(3)差异蛋白组学方法检测2D-PAGE结合Nano-LC-MS/MS鉴定CP中锰毒性差异谱.(4)Western blot及Real time RT PCR验证锰差异蛋白.(5) siRNA及转染技术建立PHB1敲低型细胞系.(6)流式细胞术测定细胞周期.结果与结论 (1)以2-DE结合nanoLC-IT-MS的方法在CP中鉴定到了32个锰毒性病程相关的差异蛋白质,其中有27个上调蛋白,5个下调蛋白.GO分类分析后发现差异表达蛋白主要分布在线粒体、膜表面以及细胞质内,以结合、催化活性以及转运功能为主,参与代谢与转运等生物学过程.(2)对6个差异蛋白进行体内外实验验证,证实了通过差异蛋白组学技术获得的大鼠脑脉络丛组织中锰毒性差异表达蛋白PHB1,β肌动蛋白,STIP1和TTR的变化趋势结果是可靠准确的.(3)锰作用于大鼠永生化的脉络丛上皮细胞Z310可引起PHB1时间依赖性和剂量依赖性的上调.(4)锰引起野生型Z310细胞以及空载体转染对照细胞在G1/S期的阻滞,但不引起PHB1敲低Z310细胞的周期阻滞,说明PHB1在锰致Z310细胞周期阻滞效应中具有调控作用.
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