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大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica,俗称玉米大斑病菌)引起的玉米大斑病( Northern Corn Leaf Blight)是威胁玉米生产的一种重要叶部真菌病害,常给玉米生产造成重大经济损失.PP2A是一种重要的丝/苏氨酸磷蛋白磷酸酶,该酶位于信号转导通路的下游,通过与磷酸化酶和激酶对各种靶蛋白进行去磷酸化/磷酸化修饰,调节靶蛋白活性.本试验前期利用PP2A特异性抑制剂研究发现,PP2A活性受抑制导致玉米大斑病菌产孢量及胞内黑色素合成增加.为深入研究PP2A调控病菌产孢及黑色素合成的机制,我们克隆了玉米大斑病菌2A型蛋白磷酸酶催化亚基基因(StPP2A-c),并以pBS和pU-CATPH质粒为骨架,构建了该基因的同源重组载体.本研究采用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化方法,将该同源重组载体转化到玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,用于StPP2A-c敲除突变体的创制.经潮霉素抗性(Hgy+)筛选得到抗性转化子.利用基因特异引物和潮霉素磷酸转移酶基因(hph)特异引物对转化子进行PCR验证,从3株潮霉素抗性转化子基因组DNA中扩增获得与预期大小相符的条带.进一步对此3株转化子进行Southern blot验证,其中,2株出现与预期一致的杂交信号,确认为StPP2A-c的缺失突变体,另外1株为异位整合突变体.最后,以18S rRNA作为内参,利用StPP2A-c编码区的特异引物,对这2株StPP2A-c的缺失突变体以及01-23菌株进行RT-PCR检测,结果显示,未检测到突变体中StPP2A-c基因的表达.综合上述结果表明,StPP2A-c的缺失突变体创制成功.接下来我们将针对突变体的表型及转录组进行分析,以明确PP2A在玉米大斑病菌发育及突变体过程中的调控作用.