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羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种羊属动物接触性皮肤传染病,也是人畜共患传染病之一.根据0RFv与宿主细胞相互作用的特点，本研究选定ORFV胞内复制的关键基因DNA poiymerase为靶向基因，运用RNAi技术进行靶向基因沉默的体外试验研究。通过GenBank中注册的标准株ORFV-NZ2的mRNA序列，采用网络自动筛选平台将靶序列通过基因BLAST分析以排除siRNA非特异性抑制其它基因的可能性。在594bp~984bp的靶序列上，遴选出分值较高的3个shRNA候选片段，起始点分别为596,875和947，分别命名为D-875、D-947和D-596。按照shRNA一般构成模式为:正义链TG sen TTCAAGAGA anti CTTTTTTC (Hpa I);反义链TCGAGAAAAAAG sen TCTCTTGAA anti CA(Xho I)。其中TTCAAGAGA为发夹结构;每个片段设置Xho I和Hpa I位点。靶序列引物设计:上游引物TAAGCGATCGCGCGGCGATTCACGCTTAC(SgfI);下游弓肋TAAGCGGCCGCGATGGTCCCGTTGTTGTTG(NotI)。将合成的shRNA候选片段插入慢病毒表达载体pLL3.7,构建的重组质粒分别命名为pLL3.7-D947,pLL3.7-D875,pLL3.7-D596和pLL3.7-D。PCR鉴定结果表明，重组表达载体pLL3.7-D596为阳性重组子，可用于将siRNA转染293T细胞，其它重组子仍需进一步优化。本研究结果为进行ORFV-DNA Polymeras基因沉默的体外试验奠定了基础。