【摘 要】
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目的 探讨活性氧(ROS)在喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡过程中的作用及其可能机制,为其安全性评价提供新的理论依据.方法 噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率；Hoechst33342/PI荧光染色法检测细胞凋亡形态；流式细胞术Annexin Ⅴ-FITC/PI标记法定量检测细胞凋亡率；DCFH-DA和DHE荧光探针检测细胞内的活性氧水平；Rhodamine 123染色法检测线粒体膜电位的变化；蛋白
【机 构】
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中国农业大学动物医学院,北京100193
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目的 探讨活性氧(ROS)在喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡过程中的作用及其可能机制,为其安全性评价提供新的理论依据.方法 噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率；Hoechst33342/PI荧光染色法检测细胞凋亡形态；流式细胞术Annexin Ⅴ-FITC/PI标记法定量检测细胞凋亡率；DCFH-DA和DHE荧光探针检测细胞内的活性氧水平；Rhodamine 123染色法检测线粒体膜电位的变化；蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白的表达变化.结果 喹烯酮对人肝癌HepG2细胞有明显的生长抑制作用且在一定范围内具有浓度-时间依赖性,24和48 h的IC50分别为9.2和6.7 mg·L-1.Hoechst33342/PI荧光染色结果显示,喹烯酮处理后,HepG2细胞形态表现为体积变小,核致密浓染和凋亡小体形成等典型的凋亡形态.DCFH-DA和DHE探针法检测结果表明,不同浓度喹烯酮作用HepG2细胞24 h后,细胞内活性氧水平显著升高,5.0,7.5和10 mg·L-1喹烯酮作用细胞24 h后,细胞内H2O2水平(以FITC平均荧光强度表示)分别为54 ±5.53,64 ±4.65,172±5.82,与对照组46±3.20相比,各组均高于对照组的荧光强度(P＜0.05),细胞内O2-水平(以PE平均荧光强度表示)分别为209 ±22.35,262 ±20.27,314 ±27.82,与对照组159±18.36相比,各组均高于对照组的荧光强度(P＜0.05),抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能显著抑制喹烯酮诱导的细胞内活性氧水平的升高.Rhodamine 123染色结果显示,喹烯酮处理12h后,细胞线粒体膜电位下降,而NAC能阻断喹烯酮引起的线粒体膜电位的下降.Annexin Ⅴ-FITC/PI流式检测结果显示,10 mmol·L-1 NAC +12.5 mg·L-1喹烯酮同12.5 mg·L-1喹烯酮相比,早期凋亡比率由10.9±0.55降为3.6 ±0.43,AnnexinⅤ +/PI+(晚期凋亡或坏死)比率由18.8 ±0.87减少至2.8±0.42,表明NAC能有效抑制喹烯酮所致HepG2细胞凋亡.蛋白免疫印迹检测结果显示,NAC能显著抑制凋亡相关蛋白胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3、Bid、Bax/Bcl-2和PARP-1的表达及活化.结论 喹烯酮能抑制HepG2细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能与活性氧的升高有关.
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