黑曲霉是一种常见的丝状真菌,作为重要的发酵工业菌种,可用于生产柠檬酸.丝状真菌在深层发酵过程中,随组织器官和培养条件的变化会出现不同的形态,而菌丝体的形态对目标产物的产率有显著的影响.研究表明,丝状真菌的微观形态发展决定了菌丝体的最终宏观形态,而菌丝体的形态发生过程是受形态基因调控的.因此,可以通过分子生物学的手段调控形态基因的表达,进而提高目标产物的产量.细胞壁是丝状真菌细胞外的重要结构,主要是由葡聚糖、甘露聚糖和几丁质等物质组成,几丁质作为其中的主要成分,其合成过程复杂,而其中的关键酶是几丁质合成酶,它的作用是催化 N-乙酰葡萄糖胺残基通过 β-1,4-糖苷键连接成几丁质,维持细胞壁的完整性和菌丝正常有序地极化生长,因此,对几丁质合成酶基因的表达调控成为本研究的重点.本研究以黑曲霉原始菌株(Aspergillus niger CBS 513.88)为实验材料,采用RNA干扰(RNAi)技术,使黑曲霉的几丁质合成酶基因chs发生沉默效应,进而优化黑曲霉菌丝体的发酵形态,提高柠檬酸产量.首先将扩增得到的chs基因片段连接到干扰载体pJL43-RNAi上,然后通过聚乙二醇(PEG)介导,将构建的干扰载体插入制备好的黑曲霉原生质体中,经过转化和抗性筛选,从再生的转化子中挑出2株菌落形态差异较大的chs基因的形态突变株S1、S2.通过对发酵液进行显微镜观察,结果表明突变株菌丝体的宏观和微观形态较原始菌株都发生了变化,形态突变株S1、S2都形成利于柠檬酸积累的直径不超过1mm的细小而致密的菌球,此外,菌球的边缘比原始菌株光滑,且分支频率明显降低；通过反转录PCR(RT-PCR)检测突变株中chs基因的沉默水平,发现突变株S1和S2在mRNA的表达水平都发生了不同程度的沉默；通过测定柠檬酸的产量,发现形态突变株S1和S2的产量分别比原始株提高了44.64％和55.76％.研究结果表明,chs基因对黑曲霉的形态发生有重要作用,特别是影响菌丝的生长,该基因沉默后可以降低菌丝球的粗糙度和菌丝的分支频率,进而降低发酵液的粘度,提高发酵液的传质和传氧效率,最终实现柠檬酸产量的提高.本文揭示了黑曲霉深层发酵生产柠檬酸的过程中的菌丝体形态与柠檬酸产量之间的相关性,为工业生产过程中的代谢调控奠定了基础.