目的：干细胞因其具有快速自我更新能力和多向分化潜能,为以基因编辑为核心的基因治疗提供了理想的靶细胞来源。然而在干细胞中较低的基因打靶效率极大限制了基因治疗的临床转化。为了能够高效而且安全促进人多能干细胞外源基因定点整合,利用在类转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)基础上自主设计改造的TALE切口酶(TALENickases)针对血友病A病人特异性iPSCs(HA-iPSCs)的rDNA多拷贝位点、F8原位位点进行基因打靶,以评估TALENickases应用于人多能干细胞rDNA区和原位基因打靶的可行性。方法：单用rDNA区或原位TALENs/TALENickases转染HEK293T细胞及HA-iPSCs,通过细胞凋亡检测、CCK8检测来比较不同组别之间细胞毒性；在此基础上,使用携带外源基因F8的载体与原位修复载体联合相对应位点的TALENickases共转染HA-iPSCs,筛选得到抗性克隆后进行鉴定。结果：(1)细胞毒性检测均显示rDNA区TALENickases相比TALENs毒性更低,而在原位TALENs相比TALENickases毒性较低；(2)iPSCs打靶结果显示在rDNA区TALENickases可显著提高7kb片段的定点整合效率,原位TALENickases也能有效促进基因定点整合。结论：在HA-iPSCs中,TALENickases可以有效促进多拷贝的rDNA位点与F8原位转基因的定点整合。由于TALENickases仅能产生单链断裂(single strand break,SSB),不易产生NHEJ介导的DNA修复,即不易引起indels的产生,对于基因组的影响更小,更有利于保持基因组的完整性。