【摘 要】
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目的:通过构建人IRAK-M 基因启动子荧光素酶报告基因载体,检测其转录活性,明确核心启动子区域,并探讨转录因子AP-1 结合位点突变对启动子转录活性的影响。方法:运用UCSC 在线数据库分析人IRAK-M 基因组结构,并获得其5端上游启动子区域-1442~+161bp的DNA序列;以人肾上皮HEK293T细胞基因组DNA为模板,利用PCR 扩增该序列,并克隆到PGL3-Basic 荧光素酶报告基
【出 处】
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第九次亚洲口腔麻醉学术会议暨2016全国口腔麻醉学术年会
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目的:通过构建人IRAK-M 基因启动子荧光素酶报告基因载体,检测其转录活性,明确核心启动子区域,并探讨转录因子AP-1 结合位点突变对启动子转录活性的影响。方法:运用UCSC 在线数据库分析人IRAK-M 基因组结构,并获得其5端上游启动子区域-1442~+161bp的DNA序列;以人肾上皮HEK293T细胞基因组DNA为模板,利用PCR 扩增该序列,并克隆到PGL3-Basic 荧光素酶报告基因载体上;通过设计不同引物,进一步构建系列缺失体,共获得6 个不同长度及突变的荧光素酶报告基因载体;将构建的载体分别转染293T、A549细胞,通过双荧光素酶活性分析实验检测不同缺失体的转录活性;生物信息学方法预测转录因子结合位点;干扰预测的转录因子结合位点AP-1,检测具有转录活性启动子变体的转录活性,以及对IRAK-M 的表达影响。结果:成功构建了6 种IRAK-M 基因启动子序列的荧光素酶报告基因载体;报告基因实验结果显示,不同长度的报告质粒变体在293T、A549 细胞中都具体转录活性,且-100~+161bp 区域转录活性最强;生物信息学方法分析后,缺失-100~+161bp 区域内转录因子集中的核苷酸序列,启动子变体的转录活性显著降低;突变缺失序列中转录因子AP-1 的结合序列后,启动子转录活性也显著降低;干扰转录因子AP-1 的两个亚基c-Jun、c-Fos 发现启动子转录活性也受到抑制,且IRAK-M mRNA 表达降低。结论:人IRAK-M 基因启动子在-100~+161bp 区域具有较强的转录活性,且转录因子AP-1 在IRAK-M的转录调控过程中具有重要作用,为进一步揭示该基因生物学功能及其分子调控机制奠定基础。
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