外植体褐变是影响组培成功的一个重要因素,研究认为酚类物质的酶促氧化是组织褐变的直接原因.目前对对蝴蝶兰外植体褐变的研究,多集中在生理水平上,从基因和蛋白水平来研究褐变将有助于更清晰的认识褐变发生的分子机理,并将有助于有效防止外植体褐变,对建立蝴蝶兰优良的遗传转化体系具有重要的作用,对解决组培褐化问题具有重要的价值.我们前期的研究表明,蝴蝶兰叶外植体褐变与多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)相关,POD和PPO酶活力在接种后都有显著增加,特别在离体培养3d 后,而PAL 酶活随褐变加剧而增加.PPO,POD和PAL基因表达与对照相比也明显增加.因此推断PPO,POD以及PAL三者共同参与蝴蝶兰叶外植体酶促褐变,PPO和POD 参与褐变启动,PAL与褐变进程相关.本研究主要以PPO为研究对象,以蝴蝶兰为研究材料,分析了蝴蝶兰外植体组织培养早期PPO酶活性的变化,通过western blot检测了早期PPO蛋白表达变化,通过免疫组织化学染色方法对PPO在蝴蝶兰外植体中进行免疫组织定位；探讨PPO蛋白在蝴蝶兰外植体中的时空表达,以期从PPO的时空分析方面为认识褐变发生分子机理提供基础.初步研究结果表明,蝴蝶兰外植体组织培养3d,PPO 酶活性明显增加,PPO蛋白表达也增加,免疫组织初步定位PPO在蝴蝶兰外植体维管组织.在此基础上,我们也研究了蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和柠檬酸对蝴蝶兰外植体褐变及PPO 的影响,发现100mg/L CHX 和300mg/L 柠檬酸对PPO 酶活性和蛋白表达都有明显的抑制作用.目前我们的研究结果表明,PPO在蝴蝶兰外植体组培酶促褐变中起到重要作用,特别是在培养早期.但蝴蝶兰外植体酶促褐变是一个复杂的过程,PPO只是影响酶促褐变的酶的其中之一,蝴蝶兰外植体中酚类物质氧化成醌受到PPO的催化作用.酚类物质及其氧化产物醌代谢途径不仅受到PPO一种酶单一的催化作用,POD和PAL也都参与其中,共同调控了蝴蝶兰外植体组培酶促褐变.