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目的：建立稳定表达野生型GPⅡb/Ⅲa和突变型GPⅡb/ⅢaT1565C的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary，CHO)细胞系,探讨GPⅢaT1565C点突变在细胞信号转导磷酸化中的作用。
方法：从人红白血病(human erythroleukemia，HEL)细胞中提取人基因总RNA，通过RT-PCR扩增出GPⅡb、GPⅢa和GPⅢaTl565C基因。将PCR产物与质粒pcDNA3.1(+)酶切(Hind Ⅲ和NheⅠ)、连接、转化，构建出真核表达载体pcDNA3.1(+)Ⅱb、pcDNA3.1(+)Ⅲa和pcDNA3.1(+)ⅢaT1565C。采用脂质体介导基因转移法将构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)Ⅱ b与pcDNA3.1(+)Ⅲa或pcDNA3.1(+)ⅢaTl565C共转染到CHO细胞中，经G418筛选出稳定表达野生型GP Ⅱb/Ⅲa和突变型GPⅡb/IHaT1565C的CHO细胞系。流式细胞术(floweytometry,FCM)检测野生型和突变型GPⅡb/ⅢaCHO细胞表面CD41和CD61的表达。免疫沉淀、免疫印迹(Western blot)和FCM细胞内染色等方法检测野生型和突变型GPⅡb/Ⅲa CHO细胞经纤维蛋白原(fibrinogen，Fbg)激活后发生的粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)酪氨酸磷酸化和丝氨酸磷酸化。
结果：成功获得GP Ⅱ b、GpⅢa和GPⅢaT1565C基因及其真核表达载体。pcDNA3.1(+)ⅢaT1565C经酶切、PCR和测序分析,除引入突变位点产生预期T1565C突变外,其余碱基序列无改变。FCM检测野生型和突变型GP Ⅱ b/Ⅲa CHO细胞其表面CD41和CD61均高效表达，分别为97.19％和99.71％。免疫沉淀、Western blot检测野生型和突变型GPⅡb/ⅢaCHO细胞经Fbg激活90min分别有16.24％和20.44％的FAK发生酪氨酸磷酸化；FCM细胞内染色检测其经Fbg激活90min不发生FAK丝氨酸磷酸化,激活48h分别有34.89％和73.84％发生FAK丝氨酸磷酸化。
结论：成功构建稳定表达野生型GPⅡb/Ⅲa和突变型GPⅡb/ⅢaT1565C的CHO细胞系。GPⅢaT1565C点突变能够增强细胞内信号转导关键成分FAK酪氨酸磷酸化和丝氨酸磷酸化，进而增强GPb/Ⅲa介导的细胞外向内信号转导功能。