论文部分内容阅读
目的:1、研究观察小鼠局灶性脑缺血再灌注后SVZ区星形胶质细胞和小胶质细胞不同时间点的形态及数目的变化。2、探讨A2AR基因敲除对小鼠局灶性脑缺血再灌注后SVZ区星形胶质细胞和小胶质细胞激活的影响。方法:采用大脑中动脉栓塞法复制脑缺血再灌注模型,将动物随机分为假手术组(S组),模型组(M),其中模型组根据基因型分为A2AR基因敲除模型组(MKO)和A2AR基因野生模型组(MWT),MKO组和MWT组根据再灌注时间分别分为1d组、3d组、7d组,假手术组分为A2AR基因敲除假手术组(SKO)和A2AR基因野生假手术组(SWT)共8组。对每只小鼠行为学进行神经行为学评分,每组随机抽取1只小鼠观察至规定时间经心脏灌注固定后取脑组织做成切片,用TTC染色观察脑缺血梗死灶;取剩下6只小鼠观察至规定时间经心脏灌注固定后做冰冻切片,用HE染色和尼氏染色液染色观察脑组织大体形态,以及用免疫荧光法观察SVZ区星形胶质细胞的特异性标记物GFAF表达和小胶质细胞特异性标记物Iba1的表达。结果:1、神经行为学评分:MKO组和MWT组在7d时与同基因型组内1d、3d比较评分明显降低,差异有意义(P<0.05);但是敲除型在3d时同组内与1d相比即有评分降低,差异有意义(P<0.05);而野生型同组内3d组同1d组比较则差异无意义。余各组相应时间点比较无统计学意义。S组评分均为0分,即无神经功能缺损症状。2、脑组织切片TTC染色:假手术组脑片均红染,未见白色梗死灶形成;M组均可见白色梗死灶,主要分布于大脑中动脉供血部位,如尾壳核和额颞顶叶皮层;MKO7d组和MWT7d组与同基因型组内1d组、3d组相比较可见梗死灶有不同程度的减小,颜色减淡。3、光镜下脑组织病理学改变:3.1HE染色假手术组脑组织无水肿、坏死,神经细胞排列整齐,边界清楚,形态正常;模型组缺血半暗区(梗死灶周围)均可见细胞数明显减少,细胞肿胀,部分细胞核固缩、深染或溶解,神经细胞及血管周围间隙扩大,组织有大量筛状空洞,梗死灶中心大量细胞坏死,组织溶解后留下空洞。3.2Nissl染色假手术组脑组织染色未见病理改变,模型组梗死灶及其缺血半暗区神经细胞数目减少,突触消失,尼氏小体多已溶解,排列疏松。4.GFAP免疫荧光结果:M组野生组均有星形胶质细胞胞体肥大,突触增多、增粗、伸长并且数目增加,而SKO组和SWT组星形胶质细胞形态无变化,S组GFAP阳性细胞数目明显低于M组,各M组对比S组P值均有意义。MKO组和MWT组小鼠在脑缺血再灌注1后SVZ区可见GFAP阳性细胞表达增多,7天后显著增加;两基因型对比,在1d、3d时对比无差异,而7d时对比有显著差异(P<0.01)。5.Iba1免疫荧光结果:S组小鼠无论野生型或者敲除型SVZ区小胶质细胞绝大多数均处于静止期,胞体较小,存在分支,突触较长且细,数目及分布无异常;M组观察到小胶质细胞呈阿米巴样改变,胞体增大呈椭圆形,突触增粗但减短,分支减少,荧光着色有所增强,数目增多;Iba1免疫荧光计数显示,局灶性脑缺血再灌注后MKO组和MWT组均有Iba1阳性细胞数目增多,均在3d时达到高峰;且两种基因型总体对比无差异,但各个时间点内对比时,1d时无差异,3d和7d均有差异(P<0.05)。6.直线相关性分析:MKO组与MWT组的小鼠脑缺血再灌注后各个时间点的神经行为学评分和SVZ区GFAP免疫荧光计数成显著负相关(r=-0.621,P<0.01),余变量间无相关关系。结论:1.动物的神经行为学、脑组织TTC染色及组织病理学三方面,表明成功制作了小鼠局灶性脑缺血再灌注模型成功模型。2、脑缺血再灌注后小鼠SVZ区域星形胶质细胞和小胶质细胞均有不同程度激活。3、A2AR受体敲除对脑缺血再灌注后星形胶质细胞和小胶质细胞的激活有一定的抑制作用,有利于控制小鼠脑损伤急性期炎症反应及后期神经功能恢复。