论文部分内容阅读
目的：观察γ-分泌酶抑制剂DAPT在不同时间点封闭Notch信号通路后NSC增殖、分化的情况,探究选择封闭Notch信号通路的最佳时机.方法：(1) NSC的培养与鉴定：④用弯头手术刀将分离出的新生SD大鼠(2-3天内)脑组织切成小碎块(约1 mm3),经200目尼龙网过滤形成的单细胞悬液在含有生长因子的无血清专用培养基内悬浮培养,并且使用TrypLTM Express消化联合机械吹打法进行传代.②对传至第5代的培养细胞,通过免疫荧光染色法鉴定神经干细胞的特异性表面标志物Nestin及经5％胎牛血清诱导分化后NSE、GFAP的表达.(2)脊髓提取液的制备：随机将15只健康的雌性成年SD大鼠分成三组,每组5只：瘫痪组用WD法制作T9平面完全性截瘫的SD大鼠脊髓损伤模型,假手术组在相同节段仅做椎板开窗,正常组不做处理,造模5d后制备各组脊髓提取液.(3)取第5代NSC随机分成七组：A组-空白对照组(即培养基中加入PBS液共同培养),B组-正常组(即培养基中加入正常脊髓提取液共同培养),C组-假手术组(即培养基中加入假手术脊髓提取液共同培养),D组-瘫痪组(即培养基中加入瘫痪脊髓提取液共同培养),E组-正常+DAPT组(即NSC培养基中加入正常脊髓提取液共同培养24h后加入DAPT),F组-假手术+DAPT组(即培养基中加入假手术脊髓提取液共同培养24h后加入DAPT)及G组-瘫痪+DAPT组(即培养基中加入瘫痪脊髓提取液共同培养24h后加DAPT).各组培养1d、2d、3d、4d、5d后,用细胞计数法测量各组神经干细胞的增殖情况,且各组分别于培养24 h、48h后提取神经干细胞的总RNA,采用逆转录-多聚酶联反应法(RT-PCR)测量神经干细胞Notch信号通路中的Notch1和Hes1 mRNA的表达水平.(4)取NSC随机分成两组：Ⅰ组对照组(培养基中加入瘫痪脊髓提取液共同培养)和Ⅱ组处理组(培养基中加入瘫痪脊髓提取液共同培养,分别于共同培养1d、2d、3d、5d、7d时加入γ-分泌酶抑制剂DAPT封闭Notch信号通路,DAPT终浓度为50umol/L),5％胎牛血清诱导分化48小时后,计算各组各封闭时间NSE阳性细胞(神经元)以及GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)所占的百分率和剩余干细胞数.各个指标用±s即均数±标准差表示,统计学分析采用SPSS11.5统计软件进行.结果：(1)神经干细胞的培养及鉴定结果：新生SD大鼠(2-3天内)脑源性细胞在体外可以大量扩增、形成球状团聚物,而且可以连续的、稳定的传代.培养到第5代的细胞Nestin免疫荧光染色(+),诱导分化后可出现GFAP、NSE免疫荧光染色呈阳性的细胞.(2)封闭notch信号通路后,与A、B、C组比较,E、F组在各时间点的细胞数和Notch1、Hes1mRNA的表达量明显降低(P＜0.05)；与D组比较,G组在各时间点的细胞数和Notch1、Hes1 mRNA的表达量明显降低(P＜0.05)；与E、F组比较,G组在各时间点的细胞数和Notch1、Hes1 mRNA的表达量较高(P＜0.05)；而A、B、C组之间在各时间点的细胞数和Notch1、Hes1 mRNA的表达量无明显差异(P＞0.05)；E、F组之间在各时间点的细胞数和Notch1、Hes1 mRNA的表达量无明显差异(P＞0.05)；D组、G组24h的Notch1与Hes1 mRNA的平均表达量均低于48h的,但差别没有统计学意义(P＞0.05).(3)封闭notch信号通路后,与Ⅰ组对照组相比,Ⅱ组处理组在各个时间点的干细胞数较少(P＜0.05),Ⅱ组处理组在共同培养2d、3d时加入DAPT,NSE阳性细胞(神经元)的百分率较高、GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)的百分率较低(P ＜0.05)；Ⅱ组处理组组内数据分析：在共同培养1d时加入DAPT的干细胞数明显少于共同培养2d、3d、5d、7d时加入DAPT (P ＜0.05),而在共同培养5d、7d时加入DAPT,其分化细胞数明显少于共同培养2d、3d时加入DAPT (P ＜0.05).结论：1.新生SD大鼠脑源性细胞不仅拥有扩增更新、分化成多类神经细胞的能力,而且原始神经细胞的表面标记物Nestin表达阳性,符合NSC的判定.2.瘫痪脊髓提取液可以上调神经干细胞Notch1和Hes1 mRNA的表达水平、促进NSC的增殖,可以较好的模拟SCI后的微环境.3.DAPT可下调NSC Notch1和Hes1 mRNA的表达水平、抑制NSC的增殖；DAPT适时(在本实验条件下,在48-72小时封闭)封闭Notch信号可以促进NSC向神经元分化.