【摘 要】
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目的 现行化学物发育神经实验的标准有美国环保署(EPA)颁布的OPPTS 870.6300及国际经合组织(OCED)颁布的TG426,这些实验均采用活体哺乳动物进行研究,费用高、耗时长,且难以满足当前新化合物神经发育毒性检测需求.由于多能干细胞(PSC)拥有独特的自我更新及定向分化能力,可分化为不同类型的神经细胞,适用于神经发育毒性(DNT)的研究.已验证的发育毒性试验——小鼠胚胎干细胞试验(ES
【机 构】
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广东出入境检验检疫技术中心,广东广州510623;广东药学院,广东广州510130 广东出入境检验
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目的 现行化学物发育神经实验的标准有美国环保署(EPA)颁布的OPPTS 870.6300及国际经合组织(OCED)颁布的TG426,这些实验均采用活体哺乳动物进行研究,费用高、耗时长,且难以满足当前新化合物神经发育毒性检测需求.由于多能干细胞(PSC)拥有独特的自我更新及定向分化能力,可分化为不同类型的神经细胞,适用于神经发育毒性(DNT)的研究.已验证的发育毒性试验——小鼠胚胎干细胞试验(EST)无法完全满足DNT筛选要求.因此需建立基于干细胞的DNT筛选试验.方法 选择小鼠胚胎干细胞系,体外培养扩增,以成体神经干细胞(如大鼠神经干细胞、海马干细胞)和神经细胞为对照.体外诱导PSC向神经细胞方向分化,从可用的诱导方法(如"4-/4+法"、"五步法"、单层细胞分化法、默认模式介导方式、基质细胞诱导法和遗传工程介导法等)中,本研究选择基质细胞诱导法.经神经元特异性标志物或电生理鉴定后,疑似神经发育毒性化合物暴露,选择阳性对照(甲基汞、镉、纳曲酮等)和阴性对照(青霉素G).选择的检测终点包含一个或多个神经发育的关键事件,如细胞增殖和凋亡、胚胎干细胞分化、神经细胞迁移、轴突树突生长和突触发生、神经胶质细胞分化和髓鞘形成、神经递质合成与功能等.综合应用分子、基因、蛋白、形态、功能等检测技术,观察和分析神经细胞的变化.结果 基于细胞的测试系统优点在于高通量、敏感度高.本研究建立的胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞的方法,以及由此建立的发育神经毒性研究,可用于神经发育毒性物质的检测.而且针对神经发育的不同时期,不同暴露时间,对特定毒性效应进行研究,通过多个检测终点的调整,可以满足化合物不同作用机制的研究.干细胞的三维培养可提供更接近与体内的环境,克服成体永生细胞系(如PC12、神经瘤细胞)等细胞类型的不足.结论 采用干细胞诱导神经分化建立高通量神经发育毒物筛选方法有效可行,可以满足对大量化学物快速筛选的要求,同时符合3R原则和基于毒性通路的现代毒理学发展趋势.
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