【摘 要】
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为了探讨嗜热细菌(Thermus thermophilus HB27)来源的海藻糖合酶基因在毕赤酵母GS115中的表达情况,将PCR得到的2900bp嗜热细菌海藻糖合酶基因TreS连接至毕赤酵母表达载体pPIC3.5k,得到质粒pPIC3.5k-TreS,通过转化得到阳性转化子.SDS-PAGE表明,在胞内检测到110KDa的特异性条带,并经HPLC分析,酶活可达到2748.3U.本文进一步比较了
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为了探讨嗜热细菌(Thermus thermophilus HB27)来源的海藻糖合酶基因在毕赤酵母GS115中的表达情况,将PCR得到的2900bp嗜热细菌海藻糖合酶基因TreS连接至毕赤酵母表达载体pPIC3.5k,得到质粒pPIC3.5k-TreS,通过转化得到阳性转化子.SDS-PAGE表明,在胞内检测到110KDa的特异性条带,并经HPLC分析,酶活可达到2748.3U.本文进一步比较了利用2A系统构建单启动子双拷贝质粒与G418浓度筛选得到的双拷贝子目的蛋白的表达及酶活对比.口蹄疫病毒(FMDV) 2A多肽可以在真核生物中实现自剪切功能,本文通过构建含有2A保守序列的嗜热细菌来源TreS双拷贝单启动子质粒Ppic3.5k-2TreS,与pPIC3.5k-TreS质粒同时转化毕赤酵母GS115,并用遗传霉素G418浓度梯度进行多拷贝子初步筛选,再利用数字微滴式PCR(ddPCR),以管家基因GAP为参比基因,绝对定量得到准确的目的基因拷贝数.通过对2A体系单启动子双拷贝菌株的发酵表达,SDS-PAGE在110KDa存在特异性条带,经HPLC检测,其酶活可达到1719.27U.对双拷贝插入菌株进行发酵表达,SDS-PAGE在110KDa存在特异性条带,经HPLC检测,其酶活可达到2892.24U.实验表明,2A表达系统中TreS酶活略有下降,分析其原因可能是由于2A短肽自剪切效率不高从而导致产生无活性蛋白聚集体.从而,本文进一步通过G418浓度筛选,由ddPCR验证,得到一株拷贝数为4的重组菌,通过HPLC分析,其酶活可达到3054U,最终转化率可达50.6 ％.
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