【摘 要】
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[目的]建立基于ELISA检测O6-烷基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltrans ferase,MGMT)-DNA交联物的方法.利用该方法检测氮芥染毒支气管上皮-16HBE细胞3h后MGMT-DNA交
【机 构】
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第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所
【出 处】
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中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛
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[目的]建立基于ELISA检测O6-烷基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltrans ferase,MGMT)-DNA交联物的方法.利用该方法检测氮芥染毒支气管上皮-16HBE细胞3h后MGMT-DNA交联体含量变化.[材料和方法]支气管上皮细胞-16HBE经10、50、200μM氮芥染毒3h,消化收集染毒细胞.采用一种商品化的DNA提取试剂-DNAiso,利用DNA加合物快速回收法(Rapid approach to DNA adduct recovery,RADAR)进行DNA-蛋白交联物(DNA-protein crosslink,DPC)提取,产物采用8mM NaOH溶解.使用SYBR Green Q-PCR技术,与DNA标准品比较,测定样品中双链DNA(Double strand DNA,dsDNA)的浓度.调整DPC样品DNA含量为2μg后,加入lU全能核酸酶-Benzonase,常温反应30min消化基因组DNA,产物与BioLegend公司的Elisa包被液混合,包被酶标板3h,经PBST洗涤3次后进行常规的抗原封闭,高度特异性识别的MGMT一抗孵育,PBST洗涤3次,二抗孵育,PBST洗涤3次后加入TMB液显色15min,加入硫酸终止液后,在酶标仪上测450 nm波长处的OD值.分别设置纯水样品或不含MGMT抗体的一抗稀释液孵育为阴性对照组,不加氮芥染毒为正常组.Elisa线性范围检测采用200μM氮芥染毒组样品,调整DNA含量为60μg,采用3倍倍比稀释若干组,经Benzonas消化后采用前述Elisa检测方法检测MGMT-DNA交联体.将检测所得OD值与对应各组DNA含量进行标准曲线和相关系数R计算,得出ELISA检测方法的线性范围. [结果]阴性对照组加入TMB液后无显色,正常组有显色,50μM及200μM氮芥染毒组显色明显加深,其中50μM氮芥染毒组MGMT-DNA交联体增加略1倍,200μM氮芥染毒组MGMT-DNA交联体增加略3倍.线性范围显示200μM氮芥染毒组样本在80ng至20ug间有良好的线性关系,相关系数R为0.98.[结论]成功建立基于ELISA检测MGMT-DNA交联体检测的方法,该方法前期样本处理简便,DPC回收率高,检测灵敏度高,线性范围宽.50、200μM氮芥染毒3h后MGMT-DNA交联体有显著增加,与类似文献报道结果一致.
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