多股β-发卡抗菌肽的分子设计、生物活性及作用机理的研究

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本实验旨在解决大量使用广谱抗生素不仅导致耐药菌在世界范围内频繁出现,其对正常菌株的杀灭作用更是对机体微生态平衡造成了严重破坏,时常引起临床的继发感染,利用β-折叠结构抗菌肽具有较高的抗菌活性及细胞选择性,通过设计一系列含有多个转角的抗菌肽获得具有更高稳定性的抗菌肽,即多股β-发卡。并在此结构的基础上,利用色氨酸拉链提高其抗菌活性,最终设计得到了一系列全新结构的抗菌肽[(WRXxRW)n-NH2,其中n=1、2、3 or 4;Xx代表转角氨基酸]并从中筛选出抗菌活性高,序列长度短的抗菌肽。首先,利用圆二色谱及红外光谱检测此系列肽在模拟膜环境中或水溶液环境中的结构构象。抑菌试验采用最小抑菌浓度(MIC)指标来判定。肽的安全性通过溶血活性和真核细胞毒性来验证。随后利用流式细胞仪,荧光分光光度计以及扫描电镜,透射电镜来探讨肽的抑菌机理。结果表明,所有抗菌肽都能达到60%以上的β-折叠(转角)结构倾向。此外,二倍体抗菌肽(n=2)表现出较强的抗菌活性,且对正常细胞几乎无毒性与溶血活性,对于所测试的所有菌株,W2(WRPGRW)2具有更高的抗菌活性,虽盐离子稳定性稍逊于3倍体,但对于实际应用的影响不大。并且W2还具有与抗生素联合作用提高抗菌活性的功效,其中与链霉素和氯霉素在杀灭大肠杆菌的作用中表现出协同作用,而对于金黄色葡萄球菌W2与环丙沙星表现出更好的协同效果。在此基础上,膜透化与完整性实验表明W2可以作用于细菌细胞膜,破坏细胞膜的完整性导致内容物流出而引起细胞死亡,并且W2和W3对细胞膜的破坏效果相当,说明W2通过物理性破坏细菌细胞膜而达到死杀菌的目的,说明多股β-发卡结构可有效降低抗菌肽的序列长度并提高细胞选择性。由此可见,基于多股β-发卡结构,W2凭借其经济,高效以及安全性高的优势具有更好的应用潜力。
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