【摘 要】
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醛缩酶不仅可以催化碳-碳键的形成,而且能在温和条件下立体选择性地产生一个或两个新的手性中心.唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3,简称NAL)是重要的醛缩酶之一,能够可逆地催化N-
【机 构】
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中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室,天津 300308
【出 处】
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第七届中国工业生物技术发展高峰论坛
论文部分内容阅读
醛缩酶不仅可以催化碳-碳键的形成,而且能在温和条件下立体选择性地产生一个或两个新的手性中心.唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3,简称NAL)是重要的醛缩酶之一,能够可逆地催化N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac).因为生物催化技术在有机合成化学中应用的基础是发现高效的生物催化剂,所以本文定位于利用合理的基因挖掘技术发现新型NAL.一种来自Clostridium difficile NAP08和Sinorhizobium meliloti AK83的NAL(分别简称为CdNAL、SmNAL)首次进行了在大肠杆菌中过量表达、纯化及活性鉴定.SmNAL是首次在非动物寄生菌中发现的NAL.CdNAL是一种四聚体的酶(123kDa),可进行高可溶表达(390mg纯酶／L发酵液)；简单的热处理之后,目的蛋白可达到90％以上的纯度；再经过一步DEAE柱层析即得电泳纯的酶.CdNAL最适反应pH为7.4(缩合方向)和7.2(裂解方向),最适反应温度为65℃.CdNAL具有良好的耐热性：在70℃温浴15分钟后能保持全部活力,活力半衰期为4.5h；经圆二色谱测定其熔解温度(蛋白质二级结构消失一半的温度)为72℃.CdNAL在pH 6.0？9.0内呈现出最适活力的85％以上,在pH 10.0、37℃下温浴24h后保留89％残余活力.CdNAL对Neu5Ac、丙酮酸、ManNAc的kcat／Km值分别为22mmol-1 L s-1、1.95mmol-1 L s-1、0.24mmol-1 L s-1.为了进一步确定它在缩合反应方向的催化活性,制备并纯化了天然缩合产物Neu5Ac、脱氧壬酮糖酸和脱氧辛酮糖酸.这三种产物是重要的生物活性分子,具有药用及保健价值.
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