【摘 要】
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目的：研究AAV介导的siRNA下调过表达“失巢凋亡”基因14-3-3ζ后肺腺癌A549细胞的生长变化情况.方法：设计靶向14-3-3ζ的siRNA,克隆到psiRNA质粒H1启动子下游,从psiRNA质粒
【机 构】
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湖南中医药大学医学院,湖南长沙410208中山大学化学与化学工程学院,广东广州,510275
【出 处】
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中国微生物学会第十六届全国微生物学教学和科研及成果产业化研讨会
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目的：研究AAV介导的siRNA下调过表达“失巢凋亡”基因14-3-3ζ后肺腺癌A549细胞的生长变化情况.方法：设计靶向14-3-3ζ的siRNA,克隆到psiRNA质粒H1启动子下游,从psiRNA质粒上扩增H1-shRNA表达单位亚克隆到含报告基因的pAAV-MCS-EGFP质粒的MlμI酶、切位点,构建重组质粒,然后在人胚肾293细胞中包装出重组病毒rAAV-14-3-3ζ-siRNA,简称rAAV-14ζ.检测细胞HT1080测定重组病毒的感染滴度.以1×104v.p./cell为起始梯度单位,rAAV-14ζ感染肺腺癌细胞系A549,通过QRT-PCR和Western-Blot双检测siRNA的抑制效果,MTT实验分析A549细胞的增殖抑制情况,PS染色法观察A549细胞凋亡情况.结果：通过酶切鉴定和测序确定重组质粒构建成功；被感染的HT1080细胞中观察到绿色荧光表达,证明rAAV包装成功.QRT-PCR实验和Western-Blot实验检测到siRNA下调14-3-3ζ基因的表达(P＜0.01,P＜0.01)；MTT实验测得A549细胞生长有变缓的趋势,但没有显著性差异(P＞0.05),凋亡实验检测到1×106v.p./cell感染量的rAAV有引起肺腺癌细胞A549凋亡的迹象,48h早期凋亡率(13.06±1.49％),晚期凋亡率(8.43±0.56％).结论：本研究证明构建的rAAV病毒能在体外细胞水平干扰A549细胞系的生长.
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