【摘 要】
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目的:评价HBV基因组核苷酸(nt) C1913A/G变异对体外病毒复制力的影响及构建HBV核心区(C区)与增强型绿色荧光蛋白(pEGFP-N1)融合基因表达载体pEGFP-Core-N1并在细胞中表达.方
【机 构】
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解放军第302医院肝衰竭诊疗与研究中心
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目的:评价HBV基因组核苷酸(nt) C1913A/G变异对体外病毒复制力的影响及构建HBV核心区(C区)与增强型绿色荧光蛋白(pEGFP-N1)融合基因表达载体pEGFP-Core-N1并在细胞中表达.方法:385例研究对象包括116例慢乙肝中度(CHB-M)患者,123例慢乙肝重度(CB-S)患者和146例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者.从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV DNA全长,统计分析C1913A/G变异的发生率,该变异引起核心蛋白第5位氨基酸残基由脯氨酸变为苏氨酸或丙氨酸.挑选代表性C1913A/G变异株通过定点突变回复为野生型对照.用BspQ Ⅰ/ScaⅠ双酶切HBV基因组,转染HepG2细胞,检测病毒复制力和HBsAg表达水平;PCR扩增含nt1913变异型和野生型的克隆HBV C区片段定向连接至pEGFP-N1真核表达载体并转染HepG2细胞.结果:CHB-M, CHB-S和ACLF三组患者C1913A/G变异检出率分别为15.52％33.33％和35.62％ (P<0.01)，C1913A变异株的复制力和HBsAg水平较野生株分别降低了32.6％和9.7％,C1913E分别降低了50.7％和9.2％。构建的pEGFP-Core-N1真核表达载体酶切、测序鉴定构建成功，转染HepG2细胞后在荧光显微镜下看到发出绿色荧光，融合蛋白成功表达。结论:(1) C1913A/G变异发生率随疾病程度加重依次增高且有统计学意义;C1913A/G变异降低HBV病毒复制力并进而降低HBsAg表达水平，可能与核心蛋白结构发生改变有关，结果提示该变异可能与慢性乙肝重症化发生机制相关。(2)成功构建了pEGFP-Core-N 1真核表达载体，并在HepG2细胞中进行了表达，为进一步研究Core区功能提供实验基础。
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