【摘 要】
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采用基因工程表达技术对实验室已经构建的BR-WT-PMD-19-T/DH5α菌株通过PCR技术扩增出CDEF四个α螺旋小分子片段,同时在片段的两端引入半胱氨酸为后期的单分子实验奠定基
【机 构】
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中国石油大学(华东)-生物工程与技术中心-蛋白质分子工程实验室,青岛
【出 处】
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中国化学会第三届全国生物物理化学会议暨国际华人生物物理化学发展论坛
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采用基因工程表达技术对实验室已经构建的BR-WT-PMD-19-T/DH5α菌株通过PCR技术扩增出CDEF四个α螺旋小分子片段,同时在片段的两端引入半胱氨酸为后期的单分子实验奠定基础.采用大肠杆菌异源表达蛋白的方法制备出融合蛋白;再以亲和层析、酶切、凝胶过滤层析等手段得到比较纯净的目的蛋白;最后以荧光光谱仪、圆二色谱仪、紫外可见光谱、单分子荧光技术为主要研究手段,对BR片段小分子蛋白构象进行细致的表征.优化了BR片段小分子蛋白的表达条件,并对酶切条件进行了摸索,将脱盐片段融合蛋白样品交换至Buffer A中,表面活性剂FC-14浓度0.1%,加入终浓度为5mM DTT,5 mM EDTA(0.5 M,100 uL),PH=7.0,4℃酶切24 h,得到较好的酶切效果.再经过纯化、凝胶层析等手段最终可纯化出BR-CDEF单体.所得单体经CD检测有二级结构,且可被AF488、AF647两种染料成功标记.
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