松树萎焉病是松树上的一种毁灭性病害,该病发展迅速,防治困难,引起了国内外的高度重视。而松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)作为其病原本身也有着复杂的生活史,由于其生理和寄生部位组织特性等限制,导致松材线虫致病机理仍然没有明确的科学解释。micro RNAs(mi RNAs)是一类长度约在21nt左右的内源性小RNA,在动植物转录后的调控机制中发挥着重要的作用。目前关于mi RNAs的研究在人类及模式植物拟南芥中较为成熟,已知人类基因中三分之一都是mi RNAs的潜在靶标基因,这些基因往往都是重要的转录与发育因子,且mi RNAs的异常表达往往会导致人类身体产生疾病,严重情况还会致人死亡。虽然目前关于松材线虫致病相关mi RNAs的研究相对较少,但不失为将其作为推进松材线虫致病机理研究的有效手段。因此我们首次对松树萎焉病发病过程中松材线虫体内的mi RNAs表达变化和调控模式进行了分析,发现并验证了一批与松材线虫致病相关的mi RNAs,初步阐明了松材线虫mi RNAs在松树萎焉病发病过程中的动态变化以及调控机制。在自然界中松材线虫又存在着强毒松材线虫和弱毒松材线虫的分化,而关于这一毒力分化的机制也未有明确的解释。有学者证明弱毒松材线虫往往表现出较弱的繁殖能力以及更为缓慢的生长周期,且不同毒力的线虫在活性氧耐受力调节的分子机制上也有所不同。通常情况下,松材线虫毒力的测定方式多为接种实验,也有其他学者提出了可以利用热激蛋白70A基因的PCR-RFLP标记来分辨松材线虫的毒力,基于全基因组序列的不同毒力线虫之间转录组与基因组水平上的差异研究则未见相关报道。因此,本研究通过高通量测序技术对4株松材线虫不同毒力虫株进行了转录组水平上的基因表达差异研究,证明了强弱毒虫株间在基因与外显子水平上都存在着明显的表达差异,并通过对这些差异基因与外显子的功能注释解释了其毒力分化的相关机理。同时,我们也对这4株不同毒力的线虫体内存在的SNP突变位点进行了全面分析,筛选出了117个可用于松材线虫毒力鉴定的SNP标记位点。主要研究结果如下:(1)通过将mi RNAs高通量测序结果与mi RBase数据库进行比对,分别在单异活体培养的松材线虫与分离自松树萎焉病发病初、中、后阶段的松材线虫体内鉴定到17、94、104和85个保守的mi RNAs。对这些保守mi RNAs表达量的初步分析发现,mi R-1、mi R-71、mi R-100以及let-7是表达量相对较高的4个mi RNAs。与之前报道的松材线虫相关mi RNAs相比,本研究发现了另外97个保守mi RNAs和许多与其他物种同源的mi RNAs。(2)利用mi RNAs的二级结构特征预测得到了256个未知的松材线虫mi RNAs,并按照序列被发现的先后顺序进行了编号以方便后期研究使用。在这些未知的mi RNAs中,19个mi RNAs在接种前后的不同时期都高度表达的,10个mi RNAs只在侵染松树后的线虫体内表达量较高,绝大多数未知mi RNAs的表达量要远低于已知的mi RNAs。(3)松树萎焉病发病过程中mi RNAs的表达模式可基本分为4大类:第1大类为mi R-100、mi R-50、mi R-87和mi R-86,这4个mi RNAs的表达量在单异活体培养时期最高;第2大类有mir-1和mi R-57等22个mi RNAs,其表达量在松材线虫侵染松树的初期达到了最高;第3大类囊括了63个mi RNAs,这一类mi RNAs在发病中期的表达量最高,到了后期则又呈现直线下降趋势;第4大类则有mi R-2、mi R-34和mi R-71等10个在松树萎蔫病发病后期显著上调的mi RNAs。可以看出,大多数mi RNAs的表达量都在发病中期达到最高值,后期明显回落。通过对以上不同时期松材线虫的计数统计也发现,松材线虫的种群数量也在发病中期达到最高点,在发病后期明显减少。这一结果与多数mi RNAs的表达模式相一致,表明了mi RNAs在松材线虫侵染松树这一致病过程中发挥着重要的作用。(4)松材线虫体内mi RNAs靶基因序列的功能富集分析表明,大部分mi RNAs的调控范围主要集中在水解酶、转移酶、催化活性以及线虫生长发育与繁殖等。通过生物信息学的预测与q PCR试验证明了mi R-73和mi R-239的靶标基因可能属于GH45纤维素酶基因家族。可以看出mi RNAs在促进松材线虫在松树体内的定殖以及协助松材线虫破解植物细胞壁等重要致病过程中发挥了重要的作用。(5)成功组装了松材线虫的去冗余转录组。共鉴定出了20,465个转录本和17,199个基因。转录本的长度大多集中在100bp到2.5kb这个区间,其中更有7条转录本的长度达到20kb以上。此前,已有学者在未公布松材线虫基因组的情况下基于de novo组装成功拼接出了松材线虫的转录组,与此相比,本研究将松材线虫的转录本数量缩小至20,465个,有904个转录本高于此前研究中组装获得的最长转录本(5,847bp),显著提升了松材线虫转录本的组装质量。(6)筛选出了238个显著差异表达的转录本,对差异转录本的聚类分析发现,3株强毒松材线虫的基因表达模式更为类似,可以被归为一类,而弱毒线虫则单独分为一类。证实了强弱毒虫株之间的基因表达差异。对这些不同毒力松材线虫差异基因的功能分析发现,强毒线虫在生长发育与繁殖相关基因的表达量上要明显高于弱毒松材线虫,这一差异间接揭示了强毒力线虫能够实现更加快速的种群数量增长从而加快其在宿主体内的定殖。同时,强毒松材线虫可能有着更高的氧化还原酶活性,这一活性可以在线虫侵染寄主的过程中保护线虫免受寄主防御机制所释放的氧化自由基的影响而提高线虫的存活率。(7)发现了84个在强弱毒线虫中差异表达的外显子,且这些差异外显子共来源自75个基因。同时在AA3、AMA3、ZL1和YW4这4个虫株中分别预测到了63、65、53和56个外显子缺失,其中有35个外显子缺失为4个虫株共有的。功能分析发现这些外显子差异主要影响松材线虫的胚胎及个体发育速率。(8)在AA3、AMA3、ZL1和YW4这4个虫株中初步发现了362563个SNP位点,其中AA3为362232(纯和:352323;杂合:9909)、AMA3为362226(纯和:352462;杂合:9764)、ZL1为362157(纯和:352522;杂合:9635)、YW4为362221(纯和:352219;杂合:10002)个SNP位点。在这些突变当中,发生最多的突变为G->A、A->G、C->T、T->C这四种类型。约有97%的SNP位点都为纯和体,而且60%以上的SNPs位点都处在内含子等非编码区域。(9)成功筛选了117个SNPs候选分子标记位点,其中45个位点位于松材线虫的外显子上,72个位点则处于内含子中。其中有4个SNP位点在转录过程中经由RNA编辑使原有的突变未能遗传到对应的RNA序列当中,且这些RNA编辑仅存在于强毒松材线虫中,并对于mi R-47的靶基因识别区域产生了影响。本研究系统描述了mi RNAs在松材线虫侵染寄主过程中的表达变化,揭示了松材线虫强弱毒虫株在分子水平上的差异性,并鉴定出了可以作为松材线虫毒力差异鉴定的SNP分子标记。以上成果推进了我们对松材线虫致病机理的研究,提供了快速有效的松材线虫毒力鉴定方法,在今后松材线虫病的预防与治理过程中有着重要作用。