【摘 要】
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目的：制备Frrs1l基因敲除小鼠,为研究其在神经系统中的作用奠定基础.方法：利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Dcbld1基因.在第二外显子两侧的非编码区各设计两个sgRNA 序列,分别将其定向克隆至pUC57-sgRNA.两个sgRNA 使用线性化的pUC57-sgRNA 重组质粒作为模板用MEGAshortscriptTM Kit 体外转录合成.将制备好的Cas9 蛋白和sgRNA 进行
【机 构】
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河北省实验动物重点实验室 河北医科大学 河北医科大学 中西医结合研究所
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目的：制备Frrs1l基因敲除小鼠,为研究其在神经系统中的作用奠定基础.方法：利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Dcbld1基因.在第二外显子两侧的非编码区各设计两个sgRNA 序列,分别将其定向克隆至pUC57-sgRNA.两个sgRNA 使用线性化的pUC57-sgRNA 重组质粒作为模板用MEGAshortscriptTM Kit 体外转录合成.将制备好的Cas9 蛋白和sgRNA 进行混合,其浓度分别为 Cas9 蛋白35 ng/μl,两个sgRNA 各5 ng/μl.采用水平显微注射法将其导入90 枚C57BL/6×B6D2F1的受精卵雄原核.将注射后存活的约80枚受精卵移植入2只当日见栓的假孕KM 雌鼠输卵管中,得到12只子代小鼠,经PCR和测序筛选目标小鼠.结果：共4 只小鼠删除了Frrs1l 基因的第2 外显子,编辑后的基因产生移码突变,并使翻译提前终止.结论：借助CRISPR/Cas9 技术得到了基因敲除小鼠,为研究Frrs1l 在神经系统中的作用提供了重要的实验条件.
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