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目的:丙酸血症(propionic acidemia, PA)是一种较常见的常染色体隐性遗传性有机酸血症,以支链氨基酸和偶数链脂肪酸代谢异常为主要特点.患病率有种族和地区差异.丙酸血症临床表现个体差异很大,患儿急性期典型临床表现为喂养困难、嗜睡、反复呕吐等症状,多在患儿摄入蛋白饮食后发作.丙酸血症的发病机制是在丙酰CoA转化为甲基丙二酰CoA过程中,催化酶丙酰CoA羧化酶活性丧失或减弱,导致体内丙酸及其代谢产物前体异常蓄积,进而出现一系列生化异常,神经系统和其它脏器损害等症状.该病的致病基因为PCCA(propionyl CoA carboxylase,alpha polypeptide)和PCCB (propionyl CoA carboxylase, beta polypeptide),分别编码组成丙酰CoA羧化酶的2个亚单位.PCCA或PCCB突变均可导致丙酰CoA羧化酶活性缺乏,引起丙酸血症.本实验室收集到一个临床确诊的丙酸血症家系,旨在对致病基因进行突变分析,为该病的基因诊断和遗传学咨询提供依据.
方法:经知情同意后采集患儿外周静脉血，提取基因组DNA，分别针对PCCA及PCCt3基因设计引物，扩增基因外显子及外显子与内含子交界部分，应用PCR及测序技术对患儿PCCA及PCCB基因进行突变筛查并用PCR结合限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)对100名正常人进行该位点突变分析。构建mini-pCAS-PCCA野生及突变型载体，转染HeLa细胞后提取总RNA,RT PCR及测序分析mRNA的剪切改变。
结果:PCCA及PCCB基因突变分析结果显示，患儿PCCe基因外显子及外显子与内含子交界处未发现碱基改变。PCCA基因中发现两处杂合碱基改变，一个是错义突变c.229C>T (p.Arg77Trp)，为已报道突变。另一个为剪切位点突变IV521+1G>A，为国际上尚未报道的碱基改变。PCR-RFLP结果显示，100名正常人均未检测到相同变异。体外mini-pCAS-PCCA载体分析结果显示mini-pCAS-PCCA野生型载体和空载均能够形成正常的转录本，mini-pCAS-PCCA突变型载体发现21内含子上隐蔽的剪切位点被激活，使部分21内含子被转录，可能造成PCCA蛋白633位撷氨酸以后的阅读框改变，从而影响PCCA蛋白功能。
结论:1. PCCA基因c.229C>T(p.Arg77Trp)和IV521+1G>A为导致中国汉族丙酸血症的致病突变，IV521+1G>A为PCCA基因的一种新的碱基变异，丰富了PCCA基因突变数据库，为丙酸血症的临床诊断和遗传学咨询提供依据。2.IVS21十1G>A剪切位点突变导致PCCA基因第21内含子中隐蔽剪切位点被激活，转录本发生改变。3.在RNA样本获得困难的情况下，体外mini-pCAS载体能够有效的预测突变对剪切的影响，为进一步分析突变基因所产生的功能变化提供依据。