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目的:该研究旨在探讨miRNA let-7f对糖尿病EPCs介导的血管新生的调节作用。
方法:⑴动物模型野生型C57BL/6雄性小鼠(8-10周龄),连续五天腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素,对照组小鼠注射枸橼酸钠缓冲液。末次注射后3-4天测定血糖浓度,筛选出血糖在280mg/dL以上者作为1型糖尿病动物模型,待血糖持续升高4-6周后用于实验。⑵EPCs的分离培养无菌分离实验小鼠股骨、胫骨、髋骨及肱骨,收集骨髓单个核细胞。将细胞按照1×106/cm2的密度接种在已包被玻连蛋白的六孔板中,置于37℃,5%CO2中培养。培养4天后第一次完全换液,以去除未贴壁的细胞后继续培养3天,即可用于实验。⑶EPCs的功能检测通过检测小管形成试验、细胞黏附试验和细胞迁移实验检测EPCs的小管形成能力、黏附能力及迁移能力。⑷Real-time PCR使用mirVanaTMmiRNA提取试剂盒提取EPCs中的miRNAs,并用Taqman microRNA反转录试剂盒进行反转录,最后使用Taqman miRNA引物和TaqManUniversal PCR Master Mix检测EPCs中let-7f的表达,并以snoRNA55作为内参照。⑸Let-7f模拟物和抑制物的转染利用DharmaFECT转染试剂I对EPCs分别转染let-7f模拟物、抑制物以及各自的随机对照。
结果:①MiRNA let-7f在1型糖尿病小鼠EPCs中的表达水平显著降低。与正常对照组小鼠分离培养的骨髓EPCs相比,1型糖尿病小鼠EPCs中miRNA let-7f的表达水平明显降低(n=6,P<0.05)。②MiRNA let-7f改善1型糖尿病小鼠EPCs受损的功能。通过模拟物转染使let-7f在糖尿病EPCs内过表达,糖尿病EPCs受损的功能明显改善,表现为小管形成、黏附和迁移能力的增加。相反,在正常EPCs中转染let.7f抑制物后其正常表达被抑制,正常EPCs形成小管的能力、黏附和迁移能力则明显下降。(n=4,P<0.05)。
结论:MiRNAlet-7f对改善1型糖尿病小鼠EPCs的功能有重要作用,调控EPCs中let-7f的表达可能是增强EPCs疗效的有效策略。
方法:⑴动物模型野生型C57BL/6雄性小鼠(8-10周龄),连续五天腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素,对照组小鼠注射枸橼酸钠缓冲液。末次注射后3-4天测定血糖浓度,筛选出血糖在280mg/dL以上者作为1型糖尿病动物模型,待血糖持续升高4-6周后用于实验。⑵EPCs的分离培养无菌分离实验小鼠股骨、胫骨、髋骨及肱骨,收集骨髓单个核细胞。将细胞按照1×106/cm2的密度接种在已包被玻连蛋白的六孔板中,置于37℃,5%CO2中培养。培养4天后第一次完全换液,以去除未贴壁的细胞后继续培养3天,即可用于实验。⑶EPCs的功能检测通过检测小管形成试验、细胞黏附试验和细胞迁移实验检测EPCs的小管形成能力、黏附能力及迁移能力。⑷Real-time PCR使用mirVanaTMmiRNA提取试剂盒提取EPCs中的miRNAs,并用Taqman microRNA反转录试剂盒进行反转录,最后使用Taqman miRNA引物和TaqManUniversal PCR Master Mix检测EPCs中let-7f的表达,并以snoRNA55作为内参照。⑸Let-7f模拟物和抑制物的转染利用DharmaFECT转染试剂I对EPCs分别转染let-7f模拟物、抑制物以及各自的随机对照。
结果:①MiRNA let-7f在1型糖尿病小鼠EPCs中的表达水平显著降低。与正常对照组小鼠分离培养的骨髓EPCs相比,1型糖尿病小鼠EPCs中miRNA let-7f的表达水平明显降低(n=6,P<0.05)。②MiRNA let-7f改善1型糖尿病小鼠EPCs受损的功能。通过模拟物转染使let-7f在糖尿病EPCs内过表达,糖尿病EPCs受损的功能明显改善,表现为小管形成、黏附和迁移能力的增加。相反,在正常EPCs中转染let.7f抑制物后其正常表达被抑制,正常EPCs形成小管的能力、黏附和迁移能力则明显下降。(n=4,P<0.05)。
结论:MiRNAlet-7f对改善1型糖尿病小鼠EPCs的功能有重要作用,调控EPCs中let-7f的表达可能是增强EPCs疗效的有效策略。