【摘 要】
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提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA，利用RT-PCR方法检测α1-酸性糖蛋白基因(α1-AGP)mRNA的差异表达;将α1-AGP基因完整开放阅读框重组至真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ之间，构建带有GFP报告基因的重组表达载体pEGFP-C1-α1-AGP;采用脂质体介导法，将pEGFP-C1-α1-AGP导入北京油鸡体外培养细胞
【机 构】
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中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100094;蚌埠医学院生物科学系,蚌埠 233000 蚌
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提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA，利用RT-PCR方法检测α1-酸性糖蛋白基因(α1-AGP)mRNA的差异表达;将α1-AGP基因完整开放阅读框重组至真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ之间，构建带有GFP报告基因的重组表达载体pEGFP-C1-α1-AGP;采用脂质体介导法，将pEGFP-C1-α1-AGP导入北京油鸡体外培养细胞中，并进行G418药物筛选和克隆化培养;通过RT-PCR和Western blot方法验证mRNA和蛋白的表达，对α1-AGP基因的时空表达、亚细胞定位以及提高基因表达率的最佳方法等方面进行了深入研究.实验结果：α1-AGP基因开放阅读框长度为612碱基，编码203个氨基酸，仅在北京油鸡肝、肺、腿肌和胸肌中有表达，可见α1-AGP为组织特异性表达;转染后24，48和72h，pEGFP-C1-α1-AGP转染率在31.3％～47.6％之间，绿色荧光主要集中在细胞核中，随着表达量的增加，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状经药物筛选和单克隆化培养，获得表达pEGFP-C1-α1-AGP融合蛋白的阳性克隆细胞株，RT-PCR与Western blot检测确认pEGFP-C1-α1-AGP已整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中，获得正常表达.在优化的条件下，阳性细胞凋亡率、形态、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著(P＞0.05).
其他文献
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本实验选用9个微卫星标记分析了2002年、2003年，2004年、2005年和2006年引进的高产褐壳蛋鸡配套系和代备品系之间的遗传关系，计算杂合度、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数、Nei氏遗传距离等统计量，分析了不同批间的遗传变异，并采用非加权类平均法(UPGMA)对各批次进行聚类.结果如下：本研究在9个微卫星位点上共检测到35个等为基因，各位点的多态信息含量在0.3146～0.6467
以我国7个地方鸡种为研究对象，利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytoehrome coxidase Ⅰ CO Ⅰ)基因序列，探讨COⅠ这—特定基因的特定区段作为DNA条形码在识别地方鸡种方面的可行性和有效性.研究结果表明：选择的这段COⅠ基因序列有22个突变位点，为13个单倍型。其中11个单倍型为各品种所特有，可以作为各品种鉴定的依据;各鸡种在不同位点突变频率不同，6个鸡种
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