【摘 要】
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目的:构建和筛选能高效、特异性抑制人GSK-3β基因表达的siRNA表达载体.方法:提取人L02细胞总RNA,RT-PCR扩增GSK-3β基因序列,克隆入pSEB-HUS真核表达载体,构建pSEB-G重组质粒.将设计、合成的3条靶向GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-G,构建siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-s
【机 构】
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中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所 北京 100050 陕西省食品药品检验所,陕西
【出 处】
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2013中国药学大会暨第十三届中国药师周
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目的:构建和筛选能高效、特异性抑制人GSK-3β基因表达的siRNA表达载体.方法:提取人L02细胞总RNA,RT-PCR扩增GSK-3β基因序列,克隆入pSEB-HUS真核表达载体,构建pSEB-G重组质粒.将设计、合成的3条靶向GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-G,构建siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G.将siRNA表达载体瞬时转染HeLa细胞,通过绿色荧光信号观察、RT-PCR和western blot检测其对GSK-3β基因和蛋白表达的影响.结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符.瞬时转染HeLa细胞后,其中的pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少,并显著抑制GSK-3β mRNA的表达及其蛋白的合成.结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制GSK-3β表达的siRNA表达载体,为进一步研究GSK-3β在炎症相关性疾病中的作用奠定基础.
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