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隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种重要的人兽共患寄生虫病,可以引起人及哺乳类、鸟类、鱼类、爬行类等动物出现腹泻或消化道症状,对于免疫缺陷或抑制病人危害更严重,甚至危及生命.随着工业化和城市化的快速进行,环境污染越来越严重,含有隐孢子虫卵囊的动物或人的粪便污染食物或饮水,存在人或动物感染隐孢子虫的风险,因此需要更适合的检测方法对动物粪便或环境样本进行检测.本研究的目的就在于建立一种简单、快速、特异性好、灵敏度高的分子生物学方法来检测粪便中的隐孢子虫.本研究根据微小隐孢子虫18S rRNA基因的4条特异LAMP引物设计2条环引物,初步建立并优化了LAMP(环介导等温扩增)方法来快速检测微小隐孢子虫.结果发现,LAMP反应过程可省去95℃热变性和80℃酶失活过程,最佳反应温度和时间分别是63℃和60min,MgSO4、Betaine、dNTP Mixture、Bst DNA聚合酶的最佳浓度分别是8mmol/L、0.8mol/L、0.8mmol/L、8U/25μL,外内引物最浓度分别为0.2μmol/L、1.2μn01/L,添加环引物后LAMP反应时间缩短为20min.该方法展现了较好的特异性,检测微小隐孢子虫出现LAMP特征性梯状条带,对贾第虫、肠阿米巴、柔嫩艾美耳球虫、类圆线虫检测则无特征性梯状条带；LAMP的检测限度为5×100个/μL,比常规PCR方法的检测限度低2个数量级(100倍)；LAMP产物经酶切验证得到预期的结果.比较LAMP产物在3个不同浓度琼脂糖中电泳,发现在1.5％的琼脂糖中电泳时,LAMP条带较分散,比较容易观测；比较4种不同的LAMP结果判断方法,发现通过SYBR Green Ⅰ显色来判断LAMP结果可用于现场快速检测.本研究对C.parvum、C.wrairi、C.muris、C.baileyi和C.serpentis的一些18s rRNA基因序列进行比对,得到保守片段,利用该保守片段设计LAMP引物,建立并优化了隐孢子虫属特异可视LAMP检测方法.LAMP反应体系优化结果为：最佳反应温度和时间分别为63℃和60min,MgSO4、dNTP Mixture、Betaine、 Bst DNA聚合酶的最佳浓度分别是8mmol/L、1.0mmol/L、0.8mol/L、8U/25μL,外内引物最浓度分别为0.2μmol/L、1.6μmol/L,添加环引物后LAMP反应时间缩短为20min.建立的LAMP方法检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、鼠隐孢子虫、安氏隐孢子虫、隐孢子虫禽基因型Ⅴ出现LAMP特征性梯状条带,经SYBR Green Ⅰ显色为(亮)绿色,而贾第虫、肠阿米巴、柔嫩艾美尔球虫、类圆线虫及双蒸水无特征性梯状条带,经SYBR Green Ⅰ显色为橙色；LAMP的检测限度是5×101个卵囊/μL,比常规PCR方法的检测限度低1个数量级(10倍)；LAMP产物经酶切验证得到了预期的结果.本研究对SYBR Green Ⅰ的使用做了系统详细的优化,发现该染料的最佳使用浓度是1000×,最佳使用量是1μL,最佳观测方法是可见光直接肉眼观测,我们还创新了一种染料添加方法,可以不开盖进行显色反应,该方法经济、实用,非常适合于LAMP结果的可视判断；LAMP产物经SYBR Green Ⅰ显色的检测限度和电泳检测限度相似.对实验室保存的样本进行检测也验证了该方法的可行性,该方法的检测敏感性和巢式PCR方法的相似.