【摘 要】
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目的：构建CYP3A4基因高表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4高表达细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响.方法：根据GenBank提供的CYP3A4基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体pLVX-acGFP 1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞.用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4高表达L02细胞株,通
【机 构】
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深圳市疾病预防控制中心毒理学重点实验室
【出 处】
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第六届中国毒理学会免疫毒理专业委员会换届及学术会议
论文部分内容阅读
目的：构建CYP3A4基因高表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4高表达细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响.方法：根据GenBank提供的CYP3A4基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体pLVX-acGFP 1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞.用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4高表达L02细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定.用不同剂量三氯乙烯对L02肝细胞和CYP3A4高表达细胞进行染毒12h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、 c-myc、 K-ras、p53)表达变化.结果：测序证明重组慢病毒高表达载体CYP3A4基因序列与GenBank提供的CYP3A4序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4高表达细胞株比正常肝细胞CYP3A4基因表达提高94倍,Westemblot实验显示CYP3A4高表达细胞株CYP3A4蛋白表达水平是正常肝细胞的2.36倍.CYP3A4高表达细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平随TCE剂量呈下降趋势,并且随染毒剂量的升高,其表达水平与相应剂量组正常肝细胞Bcl-2表达水平逐步接近；除最低剂量组外,凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平都是CYP3A4高表达细胞高于正常肝细胞.p53在CYP3A4高表达细胞中表达水平比正常肝细胞表达下降；除最低剂量组外,c-fos和c-myc基因的表达都是CYP3A4高表达细胞显著高于正常肝细胞,而k-ras基因表达是CYP3A4高表达细胞显著高于正常肝细胞.结论：三氯乙烯对正常肝细胞和CYP3A4高表达细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系.
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