论文部分内容阅读
目的 1.探讨不同剂量咖啡因慢性处理对小鼠EAE中枢炎症反应损伤的影响；2.观察小鼠EAE发病不同阶段咖啡因慢性处理的药理效应时间窗；3.观察咖啡因慢性处理对A2aR敲除小鼠EAE发病的影响,进一步明确咖啡因对中枢炎症损伤的保护作用的受体调控机制.方法 C57BL/6小鼠(野生型及A2aR敲除基因型)小鼠：雌性,体重16～20g.所有EAE模型制作：用MOG35-55混合CFA制成抗原乳剂皮内注射,CFA对照组以生理盐水代替抗原乳剂皮内注射,0、48小时腹腔注射PT造模.实验动物EAE评分：免疫当日(第0天)起,采用量化评分法,观察记录动物行为学及体重的变化.病理学观察：小鼠EAE造模后第20天与对照组同期处死,取大脑及腰髓组织.H&E染色与LFB染色评价中枢炎症细胞浸润和髓鞘脱失程度.RT-PCR)法测定小鼠大脑IFN-Y、IL-17、和TGF-β3及腺苷受体A1R、A2aR mRNA的表达.免疫组化检测中枢小胶质细胞Iba-1表达.实验一：野生型小鼠40只,随机分组,每组8只：①CFA阴性对照组；②EAE阳性对照组,③咖啡因饮水干预组(1mg·kg-1,10mg·kg-1,30mg·kg-1).实验二：野生型小鼠42只,在EAE发病不同阶段分别给予30mg· kg-1的咖啡因干预：①EAE阳性对照组(10只),无咖啡因干预；②-10天～20天全程干预组(8只),③-10天～0天干预组(8只),④0天～10天干预组(8只),⑤10天～20天干预组(8只),⑥CFA阴性对照组(6只).实验三：野生型20只,A2aR敲除基因型20只,分组：①野生型CFA阴性对照组(4只),②野生型CFA咖啡因干预组(4只),③野生型EAE阳性对照组(6只),④野生型EAE咖啡因干预组(6只),⑤A2aR敲除CFA阴性对照组(4只),⑥A2aR敲除CFA咖啡因干预组(4只),⑦A2aR敲除EAE阳性对照组(6只),⑧A2aR敲除EAE咖啡因干预组(6只).结果 1.慢性咖啡因干预组EAE病情严重程度降低,最大EAE评分下降,中枢炎症细胞浸润程度下降,病理评分降低,促炎因子IL-17、IFN-γ表达降低,抑炎因子TGF-β表达上升.呈剂量依赖性,以30mg·kg-1的剂量组最为显著.2.经咖啡因干预后,-10天～20天(全程)、1 0天～20天(发病期)干预组日均EAE评分低于EAE阳性对照组,与EAE组相比全程组最大EAE评分下降、10天～20天(发病期)干预组发病潜伏期延长(p＜0.05)、发病小鼠炎症细胞、小胶质细胞浸润相对较轻；咖啡因-10天～20天(全程)干预组炎症细胞、小胶质细胞浸润程度为最轻,病理评分较EAE阳性对照组有统计学差异(p＜0.05).-10天～20天(全程)、1 0天～20天(发病期)干预组小鼠促炎因子IL-17低于EAE阳性对照组(p＜0.05)、IFN-Y表达亦降低(p＜0.05)；-10天～20天(全程)、1 0天～20天(发病期)干预组小鼠抑炎因子TGF-β高于EAE阳性对照组(p＜0.05),同时A1R表达相对较高(p＜0.05).3.引入A2aR敲除基因型小鼠进行EAE制模,经咖啡因干预后发现：无论野生小鼠还是敲除小鼠,咖啡因干预组均比对照组潜伏期延长(p＜0.05),最大EAE评分野生型咖啡因干预组低于野生型EAE组,A2aR敲除型小鼠咖啡因干预亦低于敲除EAE组(p＜0.05).咖啡因干预组小胶质细胞浸润较EAE阳性对照组轻,髓鞘脱失状况也较轻.促炎因子检测显示咖啡因干预组IL-17、IFN-Y低于EAE阳性对照组(p＜0.05),A2aR敲除EAE咖啡因干预组抑炎因子TGF-β表达高于A2aR敲除EAE阳性对照组(p＜0.05).AR检测显示咖啡因干预组A1R的表达均较相应的EAE阳性对照组高(p＜0.05).结论 咖啡因对EAE中枢损伤有保护作用,以30mg·kg-1的剂量组最为显著.咖啡因慢性干预可以上调A1R的表达含量,可能是主要通过A1R对EAE损伤发挥保护作用的.提示咖啡因的上调A1R主要在EAE疾病发作期起作用(治疗作用而非预防作用).咖啡因对A2aR敲除基因型小鼠EAE仍表现一定的保护作用,证明这一保护作用主要是通过A1R来实现的.咖啡因作为非特异腺苷受体拮抗剂,慢性干预致A1R上调,可能是减轻EAE病情的主要机制.