【摘 要】
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[目的]：应用RNA干扰(RNAi)技术抑制大鼠C6胶质瘤中Beclin-1的表达,在体外细胞、体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,探讨靶向干预自噬基因Beclin-1对C6胶质瘤放射敏感性及电离辐射后DNA-PK依赖的DNA双链断裂(DNA DSB)损伤修复的影响.[方法]：构建靶向Beclin-1基因RNA干扰慢病毒(Beclin-1-RNAi-LV)系统,在体外及体内水平,运用RT-PCR、
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心 武汉汉口邬家墩156号 430022
【出 处】
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湖北省抗癌协会青年委员会第五届青年学术论坛
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[目的]：应用RNA干扰(RNAi)技术抑制大鼠C6胶质瘤中Beclin-1的表达,在体外细胞、体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,探讨靶向干预自噬基因Beclin-1对C6胶质瘤放射敏感性及电离辐射后DNA-PK依赖的DNA双链断裂(DNA DSB)损伤修复的影响.[方法]：构建靶向Beclin-1基因RNA干扰慢病毒(Beclin-1-RNAi-LV)系统,在体外及体内水平,运用RT-PCR、Western Blot及免疫组织化学染色检测该系统对C6胶质瘤Beclin-1 mRNA及蛋白表达的影响,运用透射电镜检测该系统对C6胶质瘤细胞电离辐射后自噬水平的影响；运用克隆形成实验在体外细胞水平,通过计算放疗后抑瘤率在体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,检测该系统对C6胶质瘤放射敏感性的影响；在体外细胞水平,通过免疫荧光染色、Western Blot及凝胶迁移滞后实验检测该系统对C6胶质瘤细胞照射后DNA DSB损伤修复情况以及DNA-PK各亚单位表达、亚细胞定位及Ku蛋白DNA结合能力的影响,在体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,运用Western Blot及免疫组织化学染色检测该系统对C6胶质瘤照射后DNA-PK亚单位表达、亚细胞定位的影响.[结果]：构建靶向Beclin-1基因RNA干扰慢病毒系统,对照组为CO-C6,慢病毒空载体感染组为NC-C6,Beclin-1-RNAi-LV感染组为KD-C6.在体外细胞水平,KD-C6组细胞Beclin-1 mRNA及蛋白表达均较CO-C6及NC-C6组细胞低,KD-C6组细胞电离辐射后自噬体的表达水平亦较CO-C6及NC-C6组细胞低,在体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,KD-C6组移植瘤Beclin-1蛋白的表达也较CO-C6及NC-C6组移植瘤低；在体外细胞水平,KD-C6组细胞SF2值(2Gy照射条件下的细胞存活分数)较CO-C6及NC-C6组细胞低,而在体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,KD-C6组移植瘤放疗后抑瘤率较CO-C6及NC-C6组移植瘤高；在体外细胞水平,KD-C6组细胞照射后γ-H2AX焦点数较多(P＜0.01),而DNA-PK各亚单位入核量及Ku蛋白DNA结合效率则明显低于CO-C6及NC-C6组细胞(P＜0.01),在体内皮下移植瘤及颅内原位移植瘤水平,KD-C6组移植瘤照射后DNA-PK亚单位表达量或入核量亦低于CO-C6及NC-C6组移植瘤.[结论]：靶向Beclin-1基因RNA干扰慢病毒系统,可显著抑制大鼠胶质瘤细胞C6自噬基因Beclin-1 mRNA的表达,可在体外及体内水平抑制C6胶质瘤Beclin-1蛋白的表达并提高C6胶质瘤的放射敏感性,这是通过抑制其照射后DNA-PK依赖的DNA DSB损伤修复来实现的.
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