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一、研究背景椎间盘退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是一种常见的慢性疾病,其发病与年龄相关,可以引发下腰疼痛导致行动受限。椎间盘退行性疾病的发病机制一直是临床的一大难题,其发生发展与椎间盘内微环境的改变密切相关。椎间盘退变中,软骨终板(cartilage endplate,CEP)因血管长入其生理性低糖环境被破坏。微环境葡萄糖可通过氨基己糖通路(hexosamine biosynthetic pathway,HBP)调控细胞内蛋白质的O-乙酰氨基葡萄糖(O-linkedβ-Nactylglucosamine,O-Glc NAc)糖基化,进而影响细胞的生物学功能。在发现软骨终板干细胞(CESCs)存在的基础上,我们发现CEP退变早期微环境葡萄糖浓度改变可能影响CESCs的分化从而参与了CEP钙化。为此,本研究将进一步探究微环境葡萄糖如何影响CESCs分化,阐明葡萄糖及O-Glc NAc糖基化在CESCs分化调控中的机制。本研究不仅可以发现CESCs分化调控的新机制,还可为改善治疗CEP钙化提供新的靶点。二、研究方法第一部分:正常/退变CEP蛋白质O-Glc NAc糖基化及骨化/软骨化检测收集脊柱骨折行腰椎融合术患者和腰椎间盘突出行腰椎融合术患者的正常和退变CEP标本,通过RT-PCR、Western Blot和免疫组化检测两组CEP中蛋白O-Glc NAc糖基化修饰水平差异,以及骨化标志物(COL1)和软骨化标志物(COL2)的表达差异。第二部分:葡萄糖影响CESCs成骨分化和成软骨分化从正常CEP组织提取并筛选CESCs。在低浓度葡糖糖(1m M)、正常浓度葡萄糖(5m M)和高浓度葡萄糖(25m M)条件下分别对CESCs进行成骨和成软骨诱导分化,通过RT-PCR和Western Blot检测成骨分化标志物(Runx2、COL1和ALP)和成软骨分化标志物(Sox9、COL2和AGN)的m RNA和蛋白质水平的表达差异,通过茜素红染色和阿尔辛蓝染色检测成骨分化标志物(钙结节)和成软骨分化标志物(酸性粘多糖)的生成差异,研究微环境中不同浓度葡萄糖对CESCs分化的影响。第三部分:O-Glc NAc糖基化影响CESCs成骨分化和成软骨分化在低糖和高糖条件下分别对CESCs进行成骨和成软骨诱导分化,使用OGlc NAc糖基化诱导剂(Thiamet-G)和抑制剂(DON),上调和下调CESCs内蛋白质O-Glc NAc糖基化修饰水平,通过RT-PCR和Western Blot检测成骨分化标志物(Runx2、COL1和ALP)和成软骨分化标志物(Sox9、COL2和AGN)的RNA和蛋白质水平的表达差异,通过茜素红染色和阿尔辛蓝染色检测成骨分化标志物(钙结节)和成软骨分化标志物(酸性粘多糖)的生成差异,研究细胞内不同水平O-Glc NAc糖基化修饰对CESCs分化的影响。第四部分:O-Glc NAc糖基化修饰Runx2/Sox9的机制研究通过免疫沉淀检测Runx2/Sox9是否可以被O-Glc NAc糖基化修饰;通过免疫荧光染色检测成骨和成软骨诱导分化过程中Runx2与Sox9与O-Glc NAc糖基化的修饰关系;第五部分:和调控Runx2/Sox9的机制研究使用O-Glc NAc糖基化诱导剂(Thiamet-G)和抑制剂(DON),上调和下调Runx2和Sox9蛋白质O-Glc NAc糖基化水平,通过RT-PCR和Western Blot检测O-Glc NAc糖基化修饰对Runx2下游分子(ALP、OCN)和Sox9下游分子(COL2)的影响。三、研究结果第一部分:与正常CEP相比,退变的CEP中蛋白质O-Glc NAc糖基化修饰水平升高,骨化标志物(COL1)含量高,软骨化标志物(COL2)含量低。第二部分:1.低糖微环境促进CESCs成软骨分化并抑制其成骨分化。2.常糖和高糖微环境促进CESCs成骨分化并抑制其成软骨分化。第三部分:1.低糖微环境中,蛋白质高O-Glc NAc糖基化修饰(Thiamet-G)抑制CESCs成软骨分化并促进其成骨分化。2.高糖微环境中,蛋白质低O-Glc NAc糖基化修饰(DON)促进CESCs成软骨分化并抑制其成骨分化。第四部分:1.Runx2和Sox9存在O-Glc NAc糖基化修饰。第五部分:1.O-Glc NAc糖基化修饰水平升高促进Runx2下游分子(ALP和OCN)m RNA和蛋白水平表达,抑制Sox9下游分子(COL2)m RNA和蛋白水平表达。四、结论1.CEP退变过程中,骨化增多,软骨化减少,蛋白质O-Glc NAc修饰水平升高。2.CEP退变过程中,微环境葡萄糖浓度升高,导致细胞内蛋白O-Glc NAc糖基化水平升高,抑制CESCs成软骨分化,促进CESCs成骨分化。3.CESCs分化核心因子Runx2和Sox9存在O-Glc NAc糖基化修饰,OGlc NAc糖基化修饰促进Runx2活性并抑制Sox9活性。