【摘 要】
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目的 克隆表达大鼠长链2-羟酸氧化酶(LCHAO),研究其对不同底物的酶动力学特征.方法 以鼠肾cDNA为模板,扩增大鼠LCHAO基因,连接到pET-28a(+)载体上构建重组质粒pET28a-rHa
【机 构】
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浙江大学药学院 药物分析与药物代谢实验室,浙江 杭州 310058
【出 处】
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第十届全国药物和化学异物代谢学术会议暨第三届国际ISSX/CSSX联合学术会议
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目的 克隆表达大鼠长链2-羟酸氧化酶(LCHAO),研究其对不同底物的酶动力学特征.方法 以鼠肾cDNA为模板,扩增大鼠LCHAO基因,连接到pET-28a(+)载体上构建重组质粒pET28a-rHa02,转化表达宿主Rosetta (DE3).利用IPTG诱导重组蛋白的表达,并通过Ni柱纯化.以SDS-PAGE和western blot分析蛋白的表达及纯度.通过监测DCIP在605 nm处吸光度值的变化来测定其对不同底物的酶动力学参数.结果 成功构建了重组质粒pET28a-rHa02(β1)和pET28a-rHa02(β2),并诱导表达了大鼠LCHAO两同工酶β1和β2.SDS-PAGE分析纯化后的蛋白只显示单一的条带,western blot鉴定其为目的蛋白.两同工酶对L-苯乳酸、2-羟基辛酸及L-扁桃酸显示出了不同的酶动力学特征.其中对2-羟基辛酸的Km最小,CLint最大,对扁桃酸的代谢具有立体选择性.结论 成功克隆表达了大鼠LCHAO两同工酶β1和β2,得到的重组酶纯度高,活性好,可为其体外底物及抑制剂的筛选提供模型,用于进一步阐明L-2-羟酸氧化酶在哺乳动物脂质生化过程中的生物学作用,以及为代谢综合症的治疗提供候选药物.
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