【摘 要】
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目的 构建钙离子通道蛋白TRPV5小激活RNA(SsRNA)慢病毒载体,建立稳定激活TRPV5表达的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK细胞)。方法 针对大鼠TRPV5基因的启动子区域,设计并合成6
【机 构】
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广州医科大学附属第一医院微创外科中心泌尿外科,广东省泌尿外科重点实验室
【出 处】
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CUA2015全国泌尿男生殖系统肿瘤专题会议(10th)暨2015年广东省医学会泌尿外科学学术年会
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目的 构建钙离子通道蛋白TRPV5小激活RNA(SsRNA)慢病毒载体,建立稳定激活TRPV5表达的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK细胞)。方法 针对大鼠TRPV5基因的启动子区域,设计并合成6条特异性SaRNA序列,连入慢病毒表达载体中构建重组载体LV3-TRPV5-SaRNA,对重组载体进行测序鉴定后通过Real-time PCR和Western blot筛选出激活效应最强的SaRNA序列并进行慢病毒颗粒包装；利用生产的慢病毒颗粒感染NRK细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性克隆后进行扩增培养,通过Real-time PCR和Western blot检测扩增后的阳性克隆细胞中TRPV5的mRNA和蛋白表达水平。结果 测序结果显示目的SaRNA序列正确插入LV3表达载体中,Real-time PCR和Western blot的检测结果显示SaRNA-320可以明显激活即上调TRPV5的mRNA和蛋白表达水平；SaRNA-320慢病毒颗粒可以明显激活TRPV5的mRNA和蛋白表达水平；SaRNA-320稳定过表达的NRK细胞中TRPV5的mRNA和蛋白表达水平明显升高。结论 成功构建了大鼠TRPV5基因的SaRNA慢病毒重组载体并获得TRPV5稳定过表达的NRK细胞株,为下一步利用小激活RNA技术研究含钙结石的病因及防治提供了新的实验基础。
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