前言肺癌是全球发病率最高、对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。近三十年来，肺癌发病率不断上升，女性尤为突出。在我国，肺癌的发病率和死亡率居男性恶性肿瘤的首位，女性发病率的第二位，死亡率的第一位。恶性肿瘤的发生和转移是受多种因素调控的复杂过程，既有肿瘤转移基因的参与，又有转移抑制基因的调控，并涉及到肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤组织新生血管形成、肿瘤细胞粘附分泌蛋白降解基质及肿瘤细胞迁移运动、逃避免疫监视等一系列过程，肿瘤的恶性程度取决于其本身的DNA含量、倍体构成及染色体畸变等各个方面。近年来发现粘附分子CD44和CD82及其变异体在肿瘤的预测、早期诊断、病情进展、转移潜能及预后的估计等方面具有很大的潜在价值。CD44基因蛋白(Cluster of Differentiation 44)是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均有表达，属于未分类的粘附分子。其正常功能是作为受体识别透明质酸(HA)和胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ等，主要参与淋巴细胞的激活以及细胞之间、细胞与介质间的特异性粘附过程，CD44基因的变异多样性表达与肿瘤的发生及转移密切相关。CD82基因蛋白(Cluster of Differentiation 82)为转膜4超家族的成员，在结构上属于细胞膜糖蛋白，其作用是促使细胞膜表面的蛋白定位，在信号传导、细胞粘附及决定细胞运动方式上起重要作用，最近研究表明CD82对多种肿瘤的转移具有抑制作用。DNA含量测定是通过反映肿瘤细胞核酸代谢状况了解其生长增殖活动的一项新方法，为临床判断肿瘤的演进状态和恶性程度提供了客观的依据。本研究应用流式细胞术检测了女性非小细胞肺癌(NSCLC)组织中CD44和CD82的表达、DNA含量和凋亡率，同时检测了女性NSCLC患者外周血淋巴细胞中CD44的表达，并分析了不同病理特征与它们之间的关系，确定它们在判断肿瘤的转移潜能和预后中的意义，为分析女性NSCLC的发生、发展、转移及诊断提供依据。材料与方法女性NSCLC患者组织61例，来源于辽宁省肿瘤医院2002～2005年手术切除标本，所有患者均经组织病理学确诊。患者为非吸烟女性，年龄33～71岁。其中鳞癌18例，腺癌43例，按UICC(1997)分期标准进行TNM分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例；低分化27例，高、中分化34例；有淋巴结转移者42例，无淋巴结转移者19例。同时取距肿块5cm以上的肺组织作为癌旁对照组；取45例同期手术的肺部良性病变(如肺结核)组织作为良性对照组。在61例肺癌患者中抽取32例患者的外周血2ml进行CD44的检测，32例患者中鳞癌8例，腺癌24例，按UICC(1997)分期标准进行TNM分期，Ⅰ期10例，Ⅱ期11例，Ⅲ期6例，Ⅳ期5例；低分化14例，高、中分化18例；有淋巴结转移者22例，无淋巴结转移者10例，正常对照组为健康献血者32人，均为女性。肺组织采用人工机械破碎法制成组织单细胞悬液，过300目尼龙网，经ficoll-hypaque密度梯度离心获取细胞悬液，外周血采用常规分离淋巴细胞的方法获取淋巴细胞悬液，并对上述两种细胞进行培养然后进行荧光染色，加入鼠抗人单克隆抗体CD44-FITC、鼠抗人单克隆抗体CD82-PE及阴性对照羊抗鼠IgG-FITC，DNA染液等。用FACSsort型流式细胞仪进行检测，采用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，进行t检验，直线相关分析。结果61例女性NSCLC患者中异倍体肿瘤占75.41％(46／61)，二倍体肿瘤占24.59％(15／61)，肺癌组CD44表达和DI(DNA index)值显著高于癌旁对照组和良性对照组(P＜0.01)，而CD82的表达和凋亡率显著低于癌旁对照组和良性对照组(P＜0.01)，癌旁对照组中CD44、CD82的表达、DI值和凋亡率与良性对照组相比差异无显著性(P＞0.05)；32例女性NSCLC患者外周血淋巴细胞中CD44的表达显著高于正常对照组。研究发现Ⅰ+Ⅱ期肺癌组织中CD44的表达和DI值低于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.01)，而CD82表达和细胞凋亡率则是Ⅰ+Ⅱ期高于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.05)；中高分化与低分化之间CD44、CD82的表达和DI值差异有显著性(P＜0.01)；有淋巴结转移者其CD44表达高于无淋巴结转移者(P＜0.05)，而CD82的表达则是有淋巴结转移者低于无淋巴结转移者(P＜0.05)。在Ⅰ+Ⅱ期肺癌外周血淋巴细胞中CD44的表达低于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.05)，中高分化与低分化之间外周血淋巴细胞中CD44的表达差异有显著性(P＜0.01)，有淋巴结转移者其CD44表达高于无淋巴结转移者(P＜0.05)。DI值和凋亡率与肺癌患者的年龄、病理组织类型、原发肿瘤大小及淋巴结转移未见相关性(P＞0.05)，CD44和CD82的表达与女性肺癌患者的年龄、原发肿瘤大小、病理组织类型等病理指标之间未见相关性(P＞0.05)。CD44在肺癌患者组织和外周血淋巴细胞中的表达有相关性(r=0.837，p＜0.01)。随着DI值不断升高，CD44的表达也逐渐升高，与DI值呈正相关(r=0.782，P＜0.01)；CD82的表达与DI值呈负相关(r=-0.652，P＜0.01)，凋亡率也与DI值呈负相关(r=-0.460，P＜0.01)；CD44的表达与CD82的表达水平呈负相关(r=-0.804，P＜0.01)。讨论肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。自19世纪中叶Laennec首次报告以来，其发病率不断上升，女性尤为突出。近年来，国内外学者针对肺癌进行了大量、广泛、深入且有价值的研究，使我们认识到肺癌的发生、发展是多因素共同作用的结果，转移是影响癌症患者预后的关键因素之一，是肺癌死亡的重要原因。在以往的研究中，大多采用免疫组化方法定性检测肺癌组织中的CD44和CD82的表达与肿瘤转移和预后的关系，本实验采用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)对61例女性NSCLC患者癌组织和距癌旁5cm以上组织及45例肺部良性病变组织中CD44、CD82的表达、DNA含量和凋亡率进行了定量检测，并联合检测了32例女性NSCLC患者外周血淋巴细胞中CD44的表达。研究结果提示CD44的表达异常可能与肺癌的发生有关，说明CD44与肺癌病情的进展密切相关，在中、晚期肺癌中高表达，CD44高表达对肺癌细胞的淋巴结转移起重要作用，可作为判断肺癌淋巴结转移的一项新指标，提示CD44在抑制T细胞凋亡的免疫调节功能，使癌细胞逃避机体免疫机制，在促进肿瘤的生长和转移中起重要作用。结合CD44在肺癌患者组织和外周血淋巴细胞中表达的相关性，提示外周血中CD44的含量与肺癌细胞中CD44的表达量有关。在CD82与NSCLC发生及转移的研究中，我们的研究结果表明CD82的表达下调可能与肺癌的发生、发展有关，CD82表达水平的降低可提高肺癌的转移潜能，它对于增加癌细胞的恶性度及促进癌细胞的转移等可能有着重要作用。在细胞癌变过程中，肿瘤细胞的生长调控发生差错，染色体畸变，使细胞DNA含量也随之改变，因此通过DNA含量的检测有助于对恶性病变的定性诊断。本研究结果提示DNA含量增加与细胞增殖活性增强在女性NSCLC中是频繁发生的。凋亡率是FCM反映细胞凋亡数量的客观指标，本研究提示肺癌的发生、发展与细胞增殖和凋亡之间平衡失调有关。在女性NSCLC中CD44、CD82、DI值和凋亡率的相关性研究中，结果说明在女性NSCLC的发生发展及转移过程中，不仅存在细胞分裂增加，增殖旺盛，而且存在凋亡细胞数目显著减少，另一方面CD44高表达与CD82低表达使肿瘤细胞间的粘附作用降低，与细胞外基质间的粘附作用增强，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力，促进转移。结论1．肺癌患者组织细胞中CD44和CD82的表达水平与女性NSCLC的临床分期、淋巴结转移和分化程度有关，说明CD44和CD82与肺癌的发生、转移有关。2．肺癌患者组织和外周血中CD44的表达有相关性。3．肿瘤细胞增殖活性增强和凋亡抑制在女性NSCLC中是频繁发生的，肺癌的发生、发展与细胞增殖和凋亡之间平衡失调有关。