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近年来,肿瘤免疫疗法作为继手术治疗、放化疗及靶向治疗之后的又一重要治疗手段,取得了巨大成功,逐渐成为肿瘤标准治疗方法之一。而溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗成果显著,代表了一种新的癌症免疫疗法。目前常用的溶瘤病毒有痘苗病毒、腺病毒、疱疹病毒等,本课题组所采用的痘苗病毒具有安全性高、基因组容量大、复制效率高、传播速度快、副作用较明确等特点。痘苗病毒TK基因的表达产物能够利用脱氧尿嘧啶核苷的类似物Brdu,使病毒核酸合成受阻,抑制痘苗病毒在细胞中的复制,进而筛选出TK基因缺失的痘苗病毒。CCL5基因和SSTR2基因具有强力抗肿瘤作用。CCL5是趋化性细胞因子CC亚家族成员,其在肿瘤的发生、发展和转归中发挥重要作用。SSTR2是一种生长抑素受体2型,其可抑制肿瘤增生、诱导肿瘤细胞凋亡,并参与免疫系统调控。本课题组在前期工作中已成功构建了重组人CCL5、SSTR2基因的痘病毒真核表达载体pSC65-CCL5-SSTR2-Luc及其对照组pSC65-Luc,并经同源重组获得重组溶瘤痘病毒,其中对照组rVV-Luc+已完成筛选工作,rVV-CCL5-SSTR2-Luc+已完成前10轮的筛选,本研究在此基础上继续研究,总共筛选了23轮,WB验证经rVV-CCL5-SSTR2-Luc+感染的肿瘤细胞可正确表达CCL5和SSTR2蛋白,证实已成功筛选纯化出可正确表达CCL5和SSTR2的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+。对病毒蚀斑和毒力的关系分析证实了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的TK基因缺失有助于痘病毒安全性的提高。应用CCK8实验对rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在体外对肿瘤细胞的杀伤活力进行了评估,结果证实rVV-CCL5-SSTR2-Luc+可抑制HCT116、HELA、HCCLM3细胞活性,其对肿瘤细胞的抑制作用随感染时间增加逐渐增强。通过对重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+发挥溶瘤作用的10个潜在效应靶点的研究,探讨了其发挥溶瘤效应的作用机制。结果表明在大部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒可能是通过激发促凋亡蛋白酶caspase-3和凋亡促进因子Bax的表达升高,促进肿瘤细胞凋亡。在部分肿瘤细胞中可应激性地激发自身抗凋亡因子survivin和Bcl2表达上调。在部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+可通过降低VEGFA蛋白表达来阻断肿瘤内皮血管的生成,进而发挥抑瘤作用。本研究为进一步开展rVV-CCL5-SSTR2-Luc+治疗肿瘤的体内研究和临床研究奠定了坚实的实验和理论基础。研究结果:1.成功筛选纯化出了可正确表达CCL5和SSTR2蛋白的重组痘病毒rVVCCL5-SSTR2-Luc+。2.对病毒蚀斑和重组痘病毒毒力的关系进行分析的结果表明rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对细胞的致病力与野生型痘病毒WR相比有所降低,证实了rVVCCL5-SSTR2-Luc+的TK基因缺失有助于痘病毒安全性的提高。对rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在体外治疗肿瘤的作用进行了评估,结果表明rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对大肠癌细胞株HCT116、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株HCCLM3的细胞活性具有抑制作用,并且rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对细胞的抑制作用随感染时间的增加逐渐增强。3.探讨了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在体外发挥溶瘤效应的作用机制。结果表明在大部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒可能是通过激发促凋亡蛋白酶caspase-3和凋亡促进因子Bax的表达升高,促进肿瘤细胞凋亡。在部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+也可通过应激性地激发自身抗凋亡因子survivin和Bcl2的表达上调或通过降低VEGFA蛋白表达来阻断肿瘤血管生成,进而发挥抑瘤作用。