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目的:糖尿病是一个日益严重的全球健康问题,是一组由多病因引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。长期的高血糖使大血管、微血管受损并危及眼、心脏、脑、肾、周围神经、足等,其中最常见的微血管并发症之一就是糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）。大约30-40%的糖尿病患者发展为DKD,其中三分之一进展为终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）。从2011年起我国三级医院住院患者中糖尿病相关慢性肾脏病患者的比例开始超过肾小球肾炎相关慢性肾脏病,且两者之间的差距不断增大。DKD的特点是肾功能下降,包括蛋白尿、肾小球硬化和小管间质纤维化。目前,导致DKD的分子机制尚不完全清楚。有证据表明表观遗传机制在DKD发病机制中起到重要作用。表观遗传学包括DNA的胞嘧啶甲基化,组蛋白翻译后修饰,以及非编码RNA。非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）是不将遗传信息编码成蛋白质的基因组RNA。ncRNA大致分为两类:一类是短ncRNAs,主要为微小RNA（micro RNA,mi RNA）,另一类是长ncRNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）。lncRNA是一类长度大于200nt的非编码RNA,以序列特异性的方式与DNA或RNA碱基配对,从而调节基因表达。根据相对于附近蛋白编码基因的位置,通常lncRNAs可分为:正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA及基因间lncRNA。其中反义lncRNA是一类基因序列与宿主基因m RNA互补,转录方向与其相反的lncRNA分子。反义lncRNA可通过转录、转录后修饰以及表观遗传学水平等多层面广泛参与调控细胞的生长、分化、发育和死亡等众多生理病理进程。课题组前期应用Arraystar Human LncRNA/m RNA表达谱芯片（v3.0）检测了糖尿病肾病患者、糖尿病正常白蛋白尿患者和健康对照人群血清中lncRNA表达谱,并进一步扩大临床研究队列,应用RT-q PCR验证芯片实验结果,发现糖尿病和糖尿病肾病患者血清中天然反义lncRNA-ARAP1-AS2表达逐渐上调,其正义链靶基因ARAP1（Arf GAP with Rho GAP domain,ankyrin repeat and PH domain1）m RNA的表达逐渐上调。但是目前,天然反义lncRNA-ARAP1-AS2对其正义链靶基因ARAP1的调控机制,以及天然反义lncRNA-ARAP1-AS2调控ARAP1介导糖尿病肾脏损伤的机制尚不清楚。天然反义lncRNA-ARAP1-AS2及其正义链靶基因ARAP1均位于第11号染色体上。ARAP1又称CENTD2,全基因组关联研究（GWAS）确定ARAP1基因上位于5’非翻译区的rs1552224和rs11603334位点是2型糖尿病风险易感位点。ARAP1包含Arf GAP,Rho GAP,SAM,RAS,PH结构域和锚蛋白重复序列,同时具有Rho GAP和磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸（PIP3）依赖性Arf GAP活性,因此ARAP1可能是磷酸肌醇,Arf和Rho类信号连接点,调节细胞活动。ARAP1是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号的重要调解者。EGFR是Erb B家族成员之一,具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体,其持续性反式激活导致TGF-β/Smad3信号传导通路的后续激活,参与DKD的发生发展,然而目前在DKD中,EGFR持续性反式激活的确切机制仍不清楚。泛素连接酶（E3）Cbl和衔接蛋白CIN85（也称为SH3KBP1）是EGFR内吞和降解的重要调节剂。有报道表明衔接蛋白CIN85可以通过形成泛素连接酶Cbl–CIN85–内啡肽复合物调节EGFR的内吞作用和泛素化。并且ARAP1可以通过与Cbl竞争CIN85的结合调节He La细胞中EGFR的内吞作用和泛素化,但是目前ARAP1及其天然反义lncRNA-ARAP1-AS2在DKD中对EGFR泛素化的调控机制仍不清楚。本研究的目的是探讨天然反义lncRNA-ARAP1-AS2对其正义链靶基因ARAP1、天然反义lncRNA-ARAP1-AS2及其正义链靶基因ARAP1对DKD中EGFR泛素化的调控机制,以及天然反义lncRNA-ARAP1-AS2及其正义链靶基因ARAP1能否通过调控EGFR的泛素化维持EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路的持续性反式激活促进糖尿病肾脏损伤,探讨靶向抑制天然反义lncRNA-ARAP1-AS2及其正义链靶基因ARAP1能否可以通过调控EGFR的泛素化抑制EGFR的持续性反式激活,减轻糖尿病状态下肾脏固有细胞细胞损伤和细胞外基质蛋白聚积。方法:通过q RT-PCR确定高糖（25mmol/L D-葡萄糖）诱导的人近端肾小管上皮细胞（human proximal tubular epithelial cells,HK-2 cells）中天然反义lncRNAARAP1-AS2和其正义链靶基因ARAP1的相对表达。通过5’3’RACE实验获得HK-2细胞中天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的全长序列。通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验观察天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的亚细胞定位。生物信息学方法验证天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的蛋白编码能力并获得其正义链靶基因ARAP1和CIN85和EGFR的蛋白质调控网络。在正常糖（5.5mmol/L D-葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）及高糖培养的HK-2细胞中转染天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒或小干扰RNA（si RNA）及其正义链靶基因ARAP1的敲低质粒,向高糖培养的HK-2细胞中加入EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478,并且在正常糖培养的HK-2细胞中共转染天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒和其正义链靶基因ARAP1的敲低质粒或共转染天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒和AG1478后,通过western blot及q RT-PCR方法验证天然反义lncRNA-ARAP1-AS2与其正义链靶基因ARAP1及EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路的关系。通过western blot及CCK8方法测定细胞外基质蛋白I型胶原蛋白（collagen I,Col I）,IV型胶原蛋白（collagen IV,Col IV）和纤连蛋白（fibronectin,FN）的表达和HK-2细胞的增殖水平。通过RNA pulldown及pulldown-seq分析验证HK-2细胞中天然反义lncRNA-ARAP1-AS2与ARAP1和CIN85的结合关系以及获得与天然反义lncRNA-ARAP1-AS2结合的m RNA。使用GO数据库对RNA pulldown下来的RNA进行功能注释。通过免疫共沉淀,双重免疫荧光验证高糖诱导的HK-2细胞,DKD患者的肾脏组织和20周龄db/db小鼠的肾脏组织中ARAP1和CIN85之间的调控机制。通过泛素化分析验证高糖诱导的HK-2细胞中ARAP1对EGFR泛素化的作用。结果:高糖培养的HK-2细胞中天然反义lncRNA-ARAP1-AS2及其正义链靶基因ARAP1的表达明显上调（P<0.05）。5’3’RACE实验成功获得了HK-2细胞中天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的全长序列。FISH实验观察到天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的亚细胞定位主要分布在细胞核。生物信息学方法验证天然反义lncRNA-ARAP1-AS2无蛋白编码能力,并获得其正义链靶基因ARAP1和CIN85和EGFR的蛋白质调控网络。在正常糖及高糖培养的HK-2细胞中,转染天然反义lncRNA-ARAP1-AS2过表达质粒后,其正义链靶基因ARAP1的表达显著上调,并且通过维持EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路的持续性激活,显著促进了细胞外基质蛋白的表达和HK-2细胞增殖（P<0.05）。相反,在正常糖及高糖培养的HK-2细胞中,转染lncRNA-ARAP1-AS2的si RNA后,ARAP1的表达显著下调,并且通过抑制EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路的持续性激活,显著抑制了细胞外基质蛋白的表达和HK-2细胞增殖（P<0.05）。在正常糖及高糖培养的HK-2细胞中,转染ARAP1的敲低质粒后,ARAP1的表达显著下调,并且通过抑制EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路的持续性激活,显著抑制了细胞外基质蛋白的表达和HK-2细胞增殖（P<0.05）。在高糖培养的HK-2细胞中加入EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478后,EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路表达水平下降,同时显著抑制了细胞外基质蛋白的表达和HK-2细胞增殖（P<0.05）。在正常糖培养的HK-2细胞中共转染天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒和其正义链靶基因ARAP1的敲低质粒后,显著抑制了由天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒引起的其正义链靶基因ARAP1、EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路以及细胞外基质蛋白的表达和HK-2细胞增殖水平的上调（P<0.05）。在正常糖培养的HK-2细胞中共转染天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒和AG1478后,显著抑制了由天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的过表达质粒引起的EGFR/TGF-β/Smad3信号传导通路以及细胞外基质蛋白的表达和HK-2细胞增殖水平的上调（P<0.05）,但是对ARAP1表达的上调没有影响。RNA pulldown及pulldown-seq分析表明,lncRNA-ARAP1-AS2下拉的复合物中富集ARAP1（Fold change=1.515187062）,但是不富集CIN85（Fold change=-1.415581462）。免疫共沉淀和双重免疫荧光结果表明在高糖培养的HK-2细胞中,ARAP1可以与CIN85结合,ARAP1和CIN85的表达及共定位均显著增多（P<0.05）。与健康对照人群相比,双重免疫荧光结果表明DKD患者的肾脏组织中的ARAP1和CIN85的表达及共定位均显著增多（P<0.05）。与正常对照db/m小鼠的肾脏组织相比,双重免疫荧光结果表明db/db小鼠的肾脏组织中的ARAP1和CIN85的表达及共定位均显著增多（P<0.05）。泛素化分析表明在高糖诱导的HK-2细胞中,敲低ARAP1后,EGFR的泛素化水平显著升高,EGFR的表达显著降低（P<0.05）。结论:（1）首次获得HK-2细胞中天然反义lncRNA-ARAP1-AS2的全长序列。在高糖培养的HK-2细胞中,lncRNA-ARAP1-AS2的表达明显上调,并且主要分布在HK-2细胞的细胞核中,可能通过促进细胞外基质蛋白聚积和细胞增殖参与DKD的肾小管间质损伤过程。（2）糖尿病状态下,天然反义lncRNA-ARAP1-AS2可能通过与其正义链靶基因ARAP1的m RNA结合,上调ARAP1的表达,促使ARAP1与CIN85的结合增多,可能通过减少CIN85与Cbl的结合,降低EGFR的泛素化水平,提高EGFR的蛋白表达水平,因此提供了更多可被高糖刺激的总EGFR蛋白,从而维持了EGFR/TGF-β/Smad3通路的激活及促进糖尿病状态下细胞外基质蛋白蓄积和细胞增殖。（3）靶向抑制天然反义lncRNA-ARAP1-AS2及其正义链靶基因ARAP1可以通过增加EGFR的泛素化抑制EGFR的持续性反式激活,减轻糖尿病状态下人近端肾小管细胞损伤和细胞外基质蛋白聚积。