论文部分内容阅读
目的:探讨转染维甲酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)在肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)缺氧损伤后转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)中的作用。 方法:构建过表达RARα慢病毒载体和阴性慢病毒载体,分别对体外培养的NRK-52E细胞进行转染。基因干扰72h后,以2.0mg/L嘌呤霉素进行筛选,采用荧光倒置相差显微镜及流式细胞术检测NRK-52E细胞的转染效率。将NRK-52E细胞分为4组:正常对照组、缺氧模型组、转染组、阴性病毒对照组。再将缺氧模型组、转染组、阴性病毒对照组NRK-52E细胞进行缺氧处理48小时,正常对照组不做任何处理。采用光学倒置显微镜观察细胞形态变化,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chainreaction,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)检测NRK-52E细胞的RARα、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及波形蛋白(vimentin)的mRNA和蛋白表达。 结果:1.荧光倒置相差显微镜观察转染组、阴性病毒对照组的NRK-52E细胞均可见均匀绿色荧光并且细胞状态良好,流式细胞术检测该两组的转染效率均>97%。转染组细胞RARα的mRNA及蛋白表达较正常对照组和阴性病毒对照组均显著升高(均P<0.05)。 2.缺氧处理48小时后,光学倒置显微镜观察到缺氧模型组与缺氧干预后的阴性病毒对照组NRK-52E细胞均出现萎缩,呈长梭型,类似肌成纤维细胞形态改变;而缺氧干预后的转染组NRK-52E细胞萎缩不明显,细胞呈多方形,基本保留上皮细胞形态。 3.与正常对照组相比,缺氧模型组NRK-52E细胞RAα、E-cadherin的mRNA和蛋白表达均显著降低(均P<0.05),而α-SMA、vimentin的mRNA和蛋白表达均显著升高(均P<0.05)。 4.缺氧干预后的转染组NRK-52E细胞RARα、E-cadherin的mRNA和蛋白表达较缺氧模型组和缺氧干预后的阴性病毒对照组均显著升高(均P<0.05),而α-SMA、vimentin的mRNA和蛋白表达较缺氧模型组和缺氧干预后的阴性病毒对照组均显著降低(均P<0.05)。与缺氧模型组相比,缺氧干预后的阴性病毒对照组的NRK-52E细胞RARα、E-cadherin、α-SMA及vimentin的mRNA和蛋白表达均无显著差异(均P>0.05)。 结论:RARα表达降低可能参与肾小管上皮细胞缺氧损伤后EMT,转染RARα可减轻肾小管上皮细胞缺氧损伤后EMT的发生。