背景上皮性卵巢癌(卵巢癌)是女性最常见的恶性肿瘤之一,其病死率高居妇科恶性肿瘤之首,由于起病隐匿、早期缺乏特异性症状与体征及有效的医学筛查手段,约70%卵巢癌患者就诊时已发生局部或远处转移,失去了手术的最佳时期,结果导致5年的总体生存率欠佳。究其原因,复发和侵袭转移是影响患者预后最主要的因素。近年的研究表明,恶性肿瘤组织中存在一小群具有干细胞样特性的细胞亚群,具有自我更新、增殖分化和侵袭转移的能力,它们是肿瘤发生、发展、侵袭和转移的根源。如果能阐明这群肿瘤细胞发生侵袭转移的分子机制,便可靶向性阻止肿瘤细胞发生侵袭转移,从而有效防止肿瘤转移。微小RNA(MicroRNA, miRNA)是一类长约18-25个核苷酸(nt)的单链非编码小分子,它们广泛存在于各种动植物中,通过剪切或抑制靶mRNA的翻译,介导基因转录后的负性调控。由于每个miRNA可以调控数十甚至数百个靶基因,因此,这些miRNA几乎对每一条信号通路都具有潜在的影响,它们广泛参与了调控人体的各种生理病理过程。越来越多证据表明,miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关,miRNA可作为癌基因或抑癌基因而起作用。研究证实,miRNA能抑制或激活多种肿瘤干细胞相关基因的表达。深入研究miRNA在肿瘤干细胞中的表达状况及其功能,对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于肿瘤的诊断、预后及治疗。Hu等研究证实在晚期卵巢癌组织中miR-200a的表达水平明显下降,miR-200a的低表达是卵巢癌患者预后不良的独立预测指标,miR-200a影响卵巢癌患者预后的机制目前尚不明确。人类miR-200a定位于染色体lp36区,在乳腺癌、结肠癌及胃癌细胞中己证实miR-200a通过抑制转录因子ZEB2的表达,诱导E-cadherin的表达,抑制上皮向间质转化(Epithelial to mesenehymal transition,EMT),从而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,但在卵巢癌肿瘤干细胞中miR-200a的作用及可能的作用途径尚不清楚。E-cadherin是细胞粘附分子cadherin家族成员,对于上皮的形成和维持具有重要作用,其功能缺失与肿瘤的侵袭和转移有关。目的本课题组前期研究中,应用microarray芯片技术检测了CD133/1+和CD133/1-细胞的miRNA表达谱,与CD133/1-细胞相比,miR-200a在CD133/1+细胞中的表达下降,本研究选取miR-200a表达下降的CD133/1+细胞为研究对象,试图探讨miR-200a对CD133/1+卵巢癌干细胞侵袭的影响及可能参与的信号途径,从而为以肿瘤干细胞为靶向的、新型的卵巢癌基因治疗提供一定的实验依据。方法1.流式细胞术分选CD133/1+卵巢癌干细胞:人卵巢癌细胞株OVCAR3在高糖型DMEM培养基中培养至对数生长期,胰酶消化,制备成单细胞悬液,细胞计数,调整细胞密度,流式细胞术分选CD133/1+和CD133/1-细胞。2.观察成熟miR-200a在CD133/1+和CD133/1-细胞的表达水平:收集上述分选的CD133/1+和CD133/1-细胞,Trizol提取总RNA,茎环法逆转录成cDNA,采用SYBR Green染料相对实时定量测定miR-200a表达水平,以U6为内参。3. Transwell侵袭和划痕实验:利用脂质体Lipofectamine2000将人工合成的miR-200a瞬时转染CD133/1+细胞,并设空白转染组及无关序列转染组,Transwell小室法和划痕实验检测各转染组细胞侵袭及迁移能力的变化。4.采用TargetScan、miRanda和PicTar方法预测miR-200a与ZEB2 mRNA 3’-UTR的互补结合位点。5.提取ZEB2 mRNA的3’-UTR,并构建3种单结合位点的突变体及3结合位点同时突变的全突变体,克隆至带有双荧光素酶的报告基因psiCHECK-2,与miR-200a或无关序列共转染后,检测荧光素酶的活性。6.用Trizol提取总RNA,采用SYBR Green染料法,实时荧光相对定量RT-PCR,测定miR-200a处理组、无关序列组及空白对照组中ZEB2和E-cadherin mRNA的转录水平,以18srRNA为内参。7.应用western blot方法检测miR-200a处理组、无关序列组及空白对照组中ZEB2和E-cadherin蛋白的表达情况。结果1.在OVCAR3细胞系中CD133/1+的细胞占0.3%。2.与CD133/1-细胞相比,成熟型miR-200a在CD133/1+细胞中的表达明显下降(1.00±0.00vs2.17±0.25,P=0.015)。3. miR-200a对CD133/1+卵巢癌干细胞侵袭和迁移的影响:侵袭实验结果显示,CD133/1+卵巢癌干细胞的穿膜个数在miR-200a处理组中是81.7±12.1,无关序列组及空白对照组的穿膜细胞数分别为162±20.7、164±23.3。与无关序列及空白对照组相比,miR-200a处理组细胞体外侵袭力明显下降(P<0.01)。24hr划痕实验结果显示,CD133/1+卵巢癌干细胞在miR-200a处理组中迁移的距离为632μm±53μm,无关序列组及空白对照组细胞迁移的距离分别为912μm±75μm、935μm±35μm。与无关序列及空白对照组相比,miR-200a处理组细胞迁移能力明显下降(P<0.01)。4.采用TargetScan、miRanda和PicTar方法预测miR-200a与ZEB2 mRNA 3’-UTR的互补结合位点共有3个,其中有2个是保守位点。5.双荧光素酶报告基因检测结果示,与无关序列及空白对照组相比,增加CD133/1+细胞内miR-200a的含量荧光素酶活性明显下降(P<0.05)。6. ZEB2 mRNA在miR-200a处理组中下降了44%,与无关序列组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);E-cadherin mRNA在miR-200a处理组中的表达是无关序列组及空白对照组相比2.35倍,差异有统计学意义(P<0.05)。7. Western blot显示,ZEB2蛋白在miR-200a处理组中下降42%,与无关序列组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。E-cadherin在miR-200a处理组中表达上调,是无关序列组及空白对照组的1.4倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.在卵巢癌OVCAR3细胞系中存在少数的CD133/1+卵巢癌干细胞,成熟型miR-200a在CD133/1+卵巢癌干细胞中的表达下降。2.增强miR-200a在CD133/1+细胞中的表达,能明显抑制CD133/1+细胞的侵袭与迁移。3.生物信息学预测与体外双荧光素酶报告基因验证ZEB2 mRNA为miR-200a的靶mRNA。4. miR-200a通过抑制核转录因子ZEB2的表达,诱导E-cadherin的表达,进一步从功能学的角度验证了ZEB2是miR-200a调控的靶基因。