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研究背景和目的结直肠癌是一种临床较常见的恶性肿瘤,在中国,其发病率和死亡率均排在第5位,每年约有19万人死于结直肠癌。近年来,微创手术联合加速康复外科以及靶向药物在结直肠癌治疗中取得了一定进展,但是这些治疗手段尚不能满足结直肠癌临床治疗需求。近些年来免疫细胞疗法得到了广泛关注,有望成为继外科手术、放射治疗、抗肿瘤化学药物治疗之后,恶性肿瘤治疗的新的突破方向。尤其是嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）修饰免疫细胞治疗受到格外关注。目前研究较成熟的是CAR-T细胞治疗,但CAR-T细胞临床治疗中发现其存在细胞因子释放综合征、脱靶效应、神经毒性等严重并发症,一定程度上限制了其广泛使用。CAR-NK细胞治疗几乎不会引起上述严重并发症,安全性明显提高。而且,CAR-NK细胞不存在异体排斥,可制备通用型免疫细胞治疗制品。目前CAR-NK治疗应用的NK细胞主要来源于外周血（Peripheral blood,PB）、脐带血（Umbilical cord blood,UCB）及NK92细胞系,三者均存在各自缺陷:外周血和脐带血来源的NK细胞不便于长期储存,供者变异性大,获得NK细胞总量不稳定;而NK92细胞体内治疗前必须经过照射灭活,但照射会大大降低CAR-NK92细胞的肿瘤杀伤能力。人多能干细胞（human pluripotent stem cells,hPSCs）在体外诱导分化为功能性NK细胞提供了新的细胞来源,同时可以在种子细胞阶段进行基因编辑,利用CAR基因修饰的多能干细胞诱导分化获得大量的性质稳定的NK细胞治疗产品,以此很好地解决外周血、脐带血来源NK细胞和NK92细胞系用于CAR-NK细胞治疗所面临的问题。癌胚抗原（CEA）在大多数进展期结直肠癌细胞表面有表达,是目前运用最为广泛的胃肠道肿瘤标志物,能被CAR-NK细胞识别并特异性结合,是结直肠癌患者CAR-NK免疫细胞治疗较为理想的靶抗原。因此,本课题通过建立靶向癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）的CAR载体修饰多能干细胞系,进一步诱导其向NK细胞分化,获得了用于结直肠癌治疗的通用型现货CAR-CEA-NK细胞治疗制品,有望为临床结直肠治疗提供新的有效治疗手段。研究方法1.构建CAR转染修饰的多能干细胞系。选择癌胚抗原（CEA）作为结直肠癌治疗的靶抗原,构建靶向CEA的CAR载体。并将其转染修饰多能干细胞,获得稳定表达CAR基因的多能干细胞系。2.规模化制备多能干细胞来源的CAR-NK细胞。体外通过spin EB方法诱导CAR基因修饰的多能干细胞在无血清培养基中高效诱导分化获得造血干/祖细胞,然后以小鼠骨髓基质细胞（OP9-DL1）提供诱导基质微环境,将造血干/祖细胞高效诱导分化为CAR-NK细胞。3.脐带血向NK细胞诱导方法的建立及NK92细胞系培养。建立脐带血向NK细胞诱导的方法以及NK92细胞系优化培养体系,以脐血来源NK细胞和NK92细胞系作为研究对照组。4.CAR-CEA-NK细胞对结直肠癌体外杀伤功能验证。选择CEA高表达（SW1116）、CEA中表达（SW837）、CEA阴性（Caco-2）三种结直肠癌细胞系,利用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验以及酶联免疫吸附实验检测干扰素（IFN-γ）释放量的方法,分别对NK细胞体外杀伤功能进行验证。5.CAR-CEA-NK细胞对结直肠癌体内肿瘤杀伤及安全性验证。以CEA高表达细胞系SW1116,构建NOD SCID小鼠异种肿瘤移植模型,用以验证多能干细胞来源的CAR-CEA-NK细胞的肿瘤杀伤功能及安全性。研究结果1.以癌胚抗原（CEA）作为靶抗原,构建靶向CEA的CAR载体并转染多能干细胞,获得稳定表达CAR基因且分化潜能良好的多能干细胞系。2.建立多hESC向NK细胞体外诱导分化的技术方法以及CAR基因修饰hESC作为NK细胞体外制备种子细胞技术方法,最终获得目标CAR CEA-NK细胞。3.CAR hESC-NK细胞与UCB-NK及NK92在细胞形态和细胞表型上具有很大程度的相似性。4.hESC-NK、UCB-NK及NK92对于结直肠癌细胞系均有一定的体外杀伤作用,组间无统计学差异,而CAR-CEA hESC-NK细胞对CEA阳性结直肠癌体外杀伤作用显著增强,但对于CEA阴性结直肠癌没有这种效应。5.CAR-CEA hESC-NK细胞对异种移植小鼠模型结直肠癌具有显著的体内杀伤作用,抗肿瘤活性显著强于Untreated组、hESC-NK治疗组、UCB-NK治疗组及NK92治疗组,并且CAR-CEA hESC-NK细胞具有很好的体内生物安全性。研究结论1.选择CEA作为靶抗原,构建针对结直肠癌的CAR-CEA修饰的多能干细胞系,多能干细胞可以作为CAR-NK研究的种子细胞,在研究起始对其进行CAR修饰,可以获得稳定表达CAR基因的多能干细胞系。2.建立多能干细胞向NK细胞分化技术方法,多能干细胞可以作为CAR-NK研究理想的NK细胞来源。3.建立CAR基因修饰多能干细胞作为NK细胞体外制备种子细胞技术方法,获得针对结直肠癌的通用型NK细胞制品。CAR修饰多能干细胞系保持向NK细胞诱导分化的潜能,且能稳定表达CAR基因。4.体外体内实验对CAR-CEA修饰的多能干细胞来源的NK细胞进行了肿瘤杀伤功能验证以及生物安全性评价。CAR-CEA修饰多能干细胞来源的NK细胞可以作为结直肠癌的有效治疗手段。综上,最终证实了嵌合抗原修饰多能干细胞来源的NK细胞在结直肠癌治疗中理想的肿瘤杀伤作用以及较好的安全性,为其下一步临床应用推广提供了可靠的理论支持。