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一、研究背景广州管圆线虫(Awgiostrowgylus cantowensis,AC)是1935年由陈心陶教授在广州家鼠体内首次发现并命名。该虫于1945年确定为人类病原体,其幼虫能打破血脑屏障进入脑内,造成严重的中枢神经系统感染性疾病,例如嗜酸性粒细胞性脑膜炎或脑膜脑炎(Eosinophilic meningitis,EM)。广州管圆线虫分布于热带和亚热带,主要流行于东南亚地区、太平洋岛屿、日本和美国。我国主要在台湾、香港、广东、浙江、福建、海南、天津、黑龙江、辽宁、上海、湖南、北京和云南等地流行。广州管圆线虫的终宿主为鼠类,中间宿主主要是软体动物,如褐云玛瑙螺或蛞蝓。广州管圆线虫1期幼虫可在中间宿主发育至感染期幼虫。人类和小鼠是其非适宜宿主,通过生食或半生食感染了广州管圆线虫的螺肉或有寄生虫污染的蔬菜感染。迄今为止,全世界已有3000多例病例报道,多数呈散在分布,但也有群体暴发流行的报道。近年来人们饮食习惯改变,加之淡水螺在我国南方地区的区域性扩散,广州管圆线虫病已成为我国部分地区最具潜在危险的食源性寄生虫病之一。广州管圆线虫病是一种幼虫移行症,能引起多个器官损伤。其幼虫在体内移行,通过肠壁、肝、肺、脑时可引起一系列机械性损伤,此外,其分泌物、代谢产物具有毒性作用。最严重的是3期幼虫可侵犯中枢神经系统,引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。此病以脑脊液中嗜酸性粒细胞显著升高为特征,病变可发生在大脑,脑膜,还可波及小脑,脑干和脊髓,脑神经和脊神经也可受累。研究表明,虫体进入中枢神经系统后,小胶质细胞被激活,并下调免疫系统反应,分泌抗炎症因子,从而调节其自身的凋亡。进一步研究小胶质细胞在嗜酸性粒细胞性脑膜炎或脑膜脑炎中的作用,将为广州管圆线虫病的临床治疗提供新的策略。MicroRNAs是一种非常丰富的保守的小型非编码RNA,它通过与信使RNA的抑制性结合或加速信使RNA的降解来调控基因的转录后表达。据报道,在感染性疾病中(包括寄生虫疾病),一些miRNAs在宿主免疫反应中通过调节凋亡发挥作用。在我们之前的研究中,总共有25个miRNA在对照组和广州管圆线虫感染组之间有差异表达,其中miR-181a-5p是唯一下调的。miR-181a-5p,是大多数脊椎动物中高度保守的miRNA,脑中含量丰富,在海马神经元的成熟过程中表达量增加。miR-181a-5p参与了细胞生物学的许多过程,如细胞命运决定和细胞侵袭。本研究中,我们检测了广州管圆线虫感染后小鼠脑组织和广州管圆线虫幼虫的排泄分泌蛋白(ESP)刺激小胶质细胞后miR-181a-5p及其预测靶基因bcl-2的表达水平,并通过上调或下调其表达来进行验证。同时进行流式细胞术,检测细胞凋亡情况。发现:广州管圆线虫感染和ESP刺激后,小鼠脑组织和小胶质细胞内miR-181a-5p的表达下调,其靶基因bcl-2的表达上调;ESP能促进小胶质细胞的凋亡,且与bcl-2/bax的比值呈负相关;转染miR-181a-5pantagomir能增加小胶质细胞bcl-2的表达,同时抑制由ESP引起的细胞凋亡。二、目的研究广州管圆线虫感染后是如何通过miR-181a-5p来调节其靶基因,从而调控细胞凋亡,进而影响感染性疾病的进程,为更好了解广州管圆线虫感染致的分子机制提供基础。三、方法1.实验动物及ESP的准备实验室感染广州管圆线虫的SD大鼠在实验室经双岐螺和大鼠之间两代循环成为稳定的实验室虫株。6-8周BALA/c小鼠每只灌胃30条三期(感染期)幼虫,其中一部分小鼠21天后从感染小鼠脑内获取幼虫,经培养获得广州管圆线虫排泄分泌蛋白。另一部分分别在感染0天、7天、14天、21天、24天后处死,获得脑组织并提取RNA和蛋白。2.miR-181a-5p agomir/antagomir转染miR-181a-5pagomir/antagomir及其阴性对照转染小鼠小胶质细胞MG-N9,采用瞬时转染的方法。3.ESP刺激小胶质细胞通过培养获得幼虫的排泄分泌蛋白ESP,用含有50μg/ml ESP的培养基培养小胶质细胞,并同时进行转染处理,收集不同刺激时间后的细胞,提取细胞总RNA和蛋白。4.Real-time PCR检测miR-181a-5 表达水平本实验采用SYBR Grenn染色法在Applied Biosystem 7500检测系统上对样品进行相对定量Real-time PCR,U6作为内参。5.Real-time PCR检测bcl-2表达水平本实验采用GoScriptTMReverse Transcription System合成试剂盒进行逆转录,用 SYBRTM Select Master Mix 检测 bcl-2 的表达水平,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作为内参。6.Westerm Blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达小鼠脑组织蛋白质通过液氮研磨法获得,小胶质细胞总蛋白通过细胞裂解法获得,表达量用Westerm Blot检测,用GAPDH作为内参。7.细胞免疫化学检测细胞内Bcl-2蛋白的表达水平收集ESP刺激后细胞,用细胞免疫化学检测小胶质细胞内Bcl-2蛋白的表达水平。8.流式细胞术检测小胶质细胞凋亡收集转染和ESP刺激后小胶质细胞,用流式细胞术检测凋亡率。9.数据分析本研究所得的结果是至少3次单独的实验,每次实验都有三个重复。采用SPSS20.0统计软件,用双侧t检验和kruskal-wallis ANOVA进行统计分析。用Pearson相关和线性回归分析miR-181a-5p和bcl-2 mRNA在感染和ESP刺激后脑组织和小胶质细胞中的相关性。P<0.05为显著性差异。四、结果1.广州管圆线虫感染和ESP刺激后miR-181a-5p负调控bcl-2广州广州管圆线虫感染小鼠后脑组织miR-181a-5p表达量下调而bcl-2上调。本研究用ESP刺激小胶质细胞来作为广州管圆线虫感染的体外验证模式。广州管圆线虫感染和ESP刺激后,脑组织和小胶质细胞miR-181a-5p表达量下调,而bcl-2的表达量上调。当上调小胶质细胞miR-181a-5p的表达,细胞中bcl-2表达水平降低;而当下调miR-181a-5p的表达,细胞中bcl-2的表达升高。2.ESP刺激和转染对小胶质细胞凋亡的影响Bcl-2是抗凋亡蛋白,本研究收集了转染和ESP刺激后的小胶质细胞,流式细后胞术显示,相对于对照组,ESP刺激后,细胞凋亡率增加;ESP刺激并转染agomir后凋亡率增加,而转染antagomir后,凋亡率降低。同时我们检测了凋亡蛋白Bax的表达,并计算bcl-2/bax比值,结果显示bcl-2/bax比值与小胶质细胞凋亡率呈负相关。五、结论1.在广州管圆线虫排泄分泌蛋白ESP刺激后的小胶质细胞中,miR-181a-5p及其预测靶基因bcl-2的表达呈负相关。2.ESP能促进小胶质细胞的凋亡,转染miR-181a-5p antagomir能上调小胶质细胞bcl-2的表达,同时减轻由ESP引起的细胞凋亡,提示miR-181a-5p可能是EM致病相关因子。