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背景慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是各种心血管疾病如:高血压、心瓣膜病、扩张型心肌病等的终末阶段。研究表明,合并CHF的患者行心脏或非心脏手术时,更容易发生心肌的缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)是目前已知最强的内源性心肌保护机制,可以显著减轻心肌的IRI。然而,在高龄、糖尿病以及高血脂等病理状态下,IPC的心肌保护作用显著减弱或消失,这可能与病理状态下某些信号蛋白激酶发生改变有关。再灌注损伤补救激酶(Reperfusion injury salvage kinase,RISK)通路主要包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)及细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)等。在再灌注早期,RISK信号通路的活化,可通过磷酸化下游糖原合酶激酶-3b(glycogen synthase kinase-3b,GSK-3b)。而抑制GSK-3b活性,是IPC介导心肌保护作用的关键环节。本课题组前期研究表明,当大鼠合并CHF时,IPC的心肌保护作用显著减弱,而吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)仍然可以发挥心肌保护作用,但其具体机制还不清楚。本研究利用盐酸多柔比星长期注射诱导大鼠CHF模型,并以正常大鼠作对照,研究RISK信号通路即PI3K/Akt和ERK通路在MPC减轻CHF大鼠心肌IRI中的作用机制。方法1.大鼠CHF模型的制备雄性SD大鼠,体重200±30 g,随机分为两个大组,盐酸多柔比星注射组(Doxorubicin,DOX)和生理盐水注射组(Normal saline,NS),DOX组大鼠尾静脉注射盐酸多柔比星2 mg/kg,每周一次,连续6周,总量达12mg/kg,NS组注射等量的生理盐水。在注射第8周末,行超声心动图检测,评价心脏功能,随机选取部分大鼠的心肌组织行HE染色,观察组织结构。2.在正常大鼠中研究RISK信号通路介导MPC心肌保护作用的机制将正常大鼠随机分为8个组:假手术组(sham,n=9)、缺血再灌注组(IR,n=9)、缺血预处理组(IPC,n=9)、1μmol/L的吗啡预处理(MPC,n=9)、MPC+wortmannin(MWT,n=9)、MPC+PD98059(MPD,n=9)以及抑制剂对照组wortmannin(WT,n=6)和PD98059(PD,n=6)组。Sham组只缝线,不结扎LAD,持续灌注K-H液。IR组灌注K-H液45 min后,并进行30 min局部缺血后120 min再灌注,制备心脏IRI模型。IPC组在IRI模型前行5 min短暂的缺血,5 min再灌注,共三个循环。MPC组先灌注15 min K-H液后,改为灌注含吗啡的K-H液(1μmol/L)进行预处理,灌注5 min,再次灌注K-H液5 min,共3个循环,然后制备心肌IRI模型。抑制剂PD98059(10μmol/L)以及wortmannin(100 nmol/L)于MPC前10 min,用溶解有抑制剂的K-H液进行灌注,至缺血开始后5 min,共45 min。各组收集冠脉流出液检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,再灌注末取下心脏行TTC染色检测梗死面积(n=6-7),另取再灌注10 min时缺血危险区的心室肌组织,采用western blot法检测p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β及β-actin的蛋白表达(n=3)。3.在CHF大鼠中研究RISK信号通路介导MPC心肌保护作用的机制第一系列研究:观察不同浓度MPC对CHF大鼠离体心脏IRI的保护作用。将CHF大鼠随机分成8组:Sham组(n=9)、IR组(n=10)、IPC组(n=10)、MPC五个剂量组(0.1、1、3、10、30μmol/L,n=6-9)。第二系列研究:研究RISK信号通路在MPC减轻CHF大鼠离体心脏IRI中的作用机制。CHF大鼠随机分为4组:MPC+wortmannin(MWT,n=9)、MPC+PD98059(MPD,n=9)、wortmannin(WT,n=6)、和PD98059(PD,n=6)。各组处理方式和冠脉流出液收取的时间点同前。另取再灌注10 min时缺血危险区的心室肌组织,采用western blot法检测p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β及β-actin的蛋白表达,q RT-PCR检测Bax/Bcl-2的基因表达情况(n=3)。结果1.成功建立大鼠CHF模型DOX组死亡率为35.6%,而NS组大鼠则全部存活。DOX组大鼠在注射过程中逐渐出现CHF的表现,如:进食量逐渐下降,体重增长缓慢甚至降低,精神萎靡等表现,而NS组大鼠进食量正常,体重稳步增加,无心力衰竭的表现。第8周末的超声心动图显示:DOX组大鼠左室射血分数(LVEF),左室短轴缩短率(LVFS)显著下降。DOX组心肌病理学心肌纤维排列紊乱,细胞核稀疏,部分心肌细胞胞浆呈现空泡化的表现。2.RISK信号通路在MPC减轻正常大鼠离体心肌IRI中的作用机制2.1 PD98059及wortmannin对MPC介导正常大鼠心肌保护作用的影响在正常大鼠离体心脏中,MPC和经典IPC均可显著减轻离体心脏IRI,缩小心肌梗死面积和降低冠脉流出液中的LDH活性。但在MPC前给予ERK抑制剂PD98059或PI3K抑制剂Wortmannin后,两者均可阻断MPC的心肌保护作用,提示MPC在正常大鼠中发挥心肌保护作用依赖于ERK或PI3K通路的活化。2.2 PD98059和wortmannin对MPC诱导正常大鼠心肌ERK、Akt及GSK-3b磷酸化的影响MPC和IPC均可显著升高缺血危险区心室肌组织中ERK与Akt的磷酸化水平,并促进下游GSK-3b磷酸化。PD98059或Wortmannin可分别抑制MPC诱导的ERK或Akt磷酸化,两者均可抑制MPC诱导的GSK-3b磷酸化。3.RISK信号通路在MPC减轻CHF大鼠离体心肌IRI中的作用机制3.1不同浓度MPC对CHF大鼠离体心脏IRI的作用在CHF大鼠中,1μmol/L和3μmol/L的MPC可以显著减轻大鼠离体心脏IRI,缩小心肌梗死面积和再灌注后冠脉流出液中LDH活性,而浓度低于1μmol/L或浓度高于10μmol/L的MPC不能有效减轻心脏的IRI。同时,IPC对CHF大鼠离体心脏的IRI没有明显保护作用。3.2 PD98059和Wortmannin对MPC介导心衰大鼠心肌保护作用的影响在MPC前加入PD98059几乎完全阻断MPC的心肌保护作用,显著增加心肌梗死面积和LDH的活性。然而,Wortmannin对MPC的心肌保护作用无明显阻断作用。提示,MPC在CHF大鼠中发挥心肌保护作用主要依赖于ERK通路,而不是PI3K通路。3.3 PD98059和Wortmannin对MPC诱导心衰大鼠心肌ERK、Akt及GSK-3b磷酸化的影响MPC可以显著升高ERK和下游GSK-3β的磷酸化水平,但不能促进Akt磷酸化。PD98059可抑制MPC诱导的ERK以及GSK-3β磷酸化。Wortmannin虽然降低Akt磷酸化水平,但对MPC诱导的GSK-3β磷酸化无明显影响。同时,IPC不能诱导ERK、Akt或GSK-3β磷酸化水平升高。3.4 PD98059和Wortmannin对MPC诱导心衰大鼠心肌凋亡相关基因表达的影响MPC可升高抗凋亡基因Bcl-2 m RNA水平,但降低促凋亡基因Bax m RNA降低,导致Bcl-2/Bax比值升高。PD98059可阻断MPC对凋亡基因的调控作用,但Wortmannin对此无明显阻断作用。同时,IPC对Bcl-2 m RNA和Bax m RNA以及Bcl-2/Bax比值没有明显影响。结论在正常大鼠中,MPC和IPC均可通过活化ERK及PI3K/Akt通路磷酸化下游GSK-3β,减轻离体心脏的IRI。而在CHF大鼠中,MPC发挥心肌保护作用的机制可能主要是通过ERK/GSK-3β通路,而不依赖于PI3K/Akt通路,继而调控凋亡相关基因表达。相反,经典IPC在CHF大鼠中不能发挥心肌保护作用,可能与其不能诱导活化RISK通路及调控下游信号分子相关。