足细胞是一种高度分化的肾小球上皮细胞,是维持肾小球滤过屏障结构和功能正常的重要组成部分。足细胞损伤是导致糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)、局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomurular sclerosis,FSGS)、膜性肾病(membranousnephropathy,MN)和微小病变肾病(Minimal-changedisease,MCD)等肾小球疾病的重要原因。尽管目前对于足细胞损伤的机制研究取得了一定的进展,但在临床治疗中仍然缺乏特异性的有效策略。越来越多的研究表明,肾脏足细胞区域内脂代谢稳态失衡是导致糖尿病肾病等肾小球疾病发生发展的主要机制,并已成为目前本领域的研究热点。JAML(junctional adhesion molecule-like protein,Amical,连接粘附分子样蛋白)是JAMs家族中新发现的一个成员,属于分泌性的I型跨膜糖蛋白。以往研究表明JAML主要分布于各种固有免疫和适应性免疫细胞中,在免疫、炎症和组织稳态中发挥重要作用。近期发现,它在内皮细胞和上皮细胞中也有表达,当细胞受损伤刺激后,JAML的表达水平可明显上调。本研究我们首次发现了JAML可介导足细胞的脂质代谢稳态调控。发现在DKD和其他肾小球疾病患者肾脏中JAML的表达显著升高,并与脂质过度沉积和肾小球滤过率降低有关。进一步实验发现,足细胞特异性敲除JAML可以明显改善DKD和阿霉素诱导的FSGS小鼠的足细胞损伤和脂代谢紊乱。在机制上,JAML通过调控Sirtl/AMPK信号通路,调节转录因子SREBP1及其下游与脂肪酸、胆固醇合成相关的靶基因,从而调控足细胞的脂质代谢。本研究进一步发展和充实了对JAML生物学功能的新认识,并为DKD等肾小球疾病的防治提供了新的靶点和思路,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究目的(1)探究新型连接粘附分子样蛋白JAML在糖尿病肾病等肾小球疾病中的表达情况。(2)阐明JAML在糖尿病肾病肾小球损伤及足细胞脂质代谢紊乱中的作用。(3)探讨JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢紊乱中的作用机制,为阐明DKD足细胞损伤的信号转导机制增加新的研究基础,并为临床探索有效延缓DKD进展的干预策略提供新的思路。研究方法第一部分:JAML在糖尿病肾病中的表达模式1.1检测临床病人血清和肾组织标本中JAML的表达情况(1)收集DKD患者(病理学分型Ⅱ型～Ⅳ型)及其他伴有蛋白尿的肾小球疾病包括FSGS、MCD及MN患者的血清和肾穿刺活检标本的病理切片。(2)记录患者的血肌酐(SCr)、估算的肾小球滤过率(eGFR)和24小时尿蛋白定量等临床化验指标。(3)酶联免疫法(ELISA)检测患者血清中JAML的水平。(4)免疫组化染色检测JAML在肾脏中的分布和表达变化。(5)分析DKD患者不同病理学分型(病理损伤严重程度不同)JAML的表达水平与损伤严重程度的关系;分析肾脏中JAML表达水平与SCr,eGFR和24小时尿蛋白定量的相关性。1.2糖尿病肾病动物模型中JAML表达变化(1)构建DKD动物模型:①自发性2型糖尿病db/db(BKS)小鼠模型:杂合子BKS db小鼠(db/m小鼠)进行自交可获得纯合子小鼠(db/db小鼠),以db/m小鼠作为阴性对照。20周雄性小鼠留取血清及肾脏标本。②低浓度STZ联合HFD制备小鼠模型:6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠给予“高脂饮食”(high fat diet,HFD)4周,单肾摘除后1周后连续3天小鼠腹腔注射低剂量链脲佐菌素(STZ,50mg/kg),继续高脂饮食喂养约12周留取肾脏标本。(2)ELISA法检测小鼠血清中JAML的水平。(3)检测肾脏中JAML的表达与定位情况:①RT-qPCR和Western blot检测肾皮质中JAML的mRNA和蛋白表达水平。②免疫组化染色检测JAML在肾脏中的分布和表达变化。③JAML和足细胞标志蛋白Synaptopodin免疫荧光双标,激光共聚焦技术观察肾小球中JAML的细胞定位和表达变化。1.3体外模拟糖尿病肾病条件检测足细胞中JAML的表达变化(1)体外模拟DKD条件建立细胞损伤模型:分别采用高糖(highglucose,HG)、糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)、棕榈酸(palmitic acid,PA)、胆固醇(cholesterol)、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)以及 DKD 患者血清处理足细胞(mouse podocyte,MPC),Western blot检测JAML蛋白水平变化。(2)给予HG及PA处理肾脏其他固有细胞包括肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cell,GECs)、系膜细胞(ratmesangial cell,RMCs)及肾小管上皮细胞(human kidney 2,HK-2),Western blot 实验检测 JAML 蛋白水平变化。1.4局灶性节段性肾小球硬化模型中JAML的表达变化(1)动物模型构建:为了验证JAML在足细胞中的作用是否具有广泛意义,给小鼠尾静脉注射阿霉素(adriamycin,ADR)(12 mg/kg)构建FSGS模型,于第5、10周取材。(2)Western blot和免疫组化染色验证JAML表达情况。(3)体外用 ADR(0.15μg/ml)刺激足细胞 24h,Western blot 及 RT-qPCR 检测JAML表达变化。第二部分:JAML在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用2.1构建JAML足细胞特异性敲除小鼠的DKD模型(1)动物模型构建:采用Cre-Loxp重组系统制备Jaml-loxp(Jamlflox/+)小鼠,并与足细胞-Cre(Podocin-Cre)小鼠进行杂交,获得足细胞特异性JAML敲除 Podocin-Cre+/Jamlfl/fl简写为 Cre+/Jamlfl/fl)小鼠。构建 STZ/HFD 诱导的Cre+/Jamlfl/fl小鼠DKD模型。另外,将Cre+/Jamlfl/fl小鼠与db/m小鼠进行杂交,最终获得足细胞特异性JAML基因敲除db/db(db/db//Cre+/Jamlfl/fl)小鼠。(2)提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型(3)验证JAML在足细胞中的敲除效率:①JAML与Synaptopodin免疫荧光共定位;②用免疫磁珠法分离肾小球,Western blot检测Cre+/Jamlfl/fl及其对照组小鼠肾小球中JAML蛋白水平。2.2足细胞JAML缺失可减轻糖尿病肾病肾脏损伤2.2.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病足细胞损伤、减轻蛋白尿(1)检测肾大体形态、血生化和肾功能等基本指标包括体重、肾重、血压、心率、尿白蛋白/肌酐比、空腹血糖、血脂等。(2)过碘酸雪夫氏染色(PAS)染色检测肾小球形态变化和硬化程度。(3)应用透射电镜观察足突数量、足突融合、基底膜厚度等。(4)免疫荧光染色足细胞损伤后的标志性分子包括肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin和Nephrin。2.2.2足细胞特异性敲除JAML可减轻肾小球炎症反应分离STZ/HFD诱导的DKD及对照组小鼠肾小球,通过RT-qPCR检测肾小球中的炎症因子白介素-6(IL-6)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达变化。2.2.3足细胞中JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞损伤利用慢病毒转染技术沉默足细胞中的JAML。(1)Western blot实验验证JAML沉默效率。(2)采用高糖(40mmol/L)刺激足细胞24h,RT-qPCR检测炎症因子变化。(3)流式细胞术检测足细胞死亡情况。(4)F-actin荧光染色激光共聚焦观察足细胞骨架重排。2.3足细胞JAML缺失可以减轻糖尿病肾病肾小球及足细胞内的脂质沉积2.3.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病小鼠肾小球及足细胞内的脂质沉积。(1)肾脏组织冰冻切片进行油红O染色,检测两种模型小鼠肾小球的中性脂质沉积。(2)利用免疫荧光双标技术,synaptopodin标记足细胞、adipophilin标记脂滴,激光共聚焦观察肾脏足细胞中脂滴的沉积。2.3.2 JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞脂质沉积利用慢病毒转染技术沉默足细胞中的JAML。(1)足细胞给予高糖(40mmol/L)刺激24h,以油红O染色和Nile Red荧光染色检测足细胞内的脂滴形成。(2)利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术进行足细胞脂质组学定量分析。2.3.3肾小球疾病患者肾活检样本中JAML与脂滴蓄积程度的相关性分析有研究表明,DKD、FSGS、MCD和MN的发病机制都与脂代谢紊乱密切相关。应用DKD、FSGS、MCD和MN患者肾活检样本的病理切片进行脂滴相关蛋白Adipophilin的免疫组化染色,分析肾脏中JAML表达水平与脂滴蓄积程度的相关性。2.4 JAML在局灶性节段性肾小球硬化足细胞脂代谢紊乱中的作用(1)采用Cre+/Jaml+/+和Cre+/Jamlfl/fl小鼠构建ADR模型,检测尿白蛋白肌酐比,PAS染色及TEM检测动物模型中肾脏形态学变化。(2)体外实验中,用ADR(0.15μg/ml)刺激足细胞24h,油红O染色检测足细胞中脂质沉积及基因沉默JAML对脂质沉积的影响。第三部分JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢稳态失衡中的作用机制3.1足细胞内JAML调控Sirt1的表达变化考虑到sirtuins是调节代谢、维持脂质和葡萄糖稳态的“主开关”,我们进一步检测了 sirtuins家族在DKD小鼠及足细胞中的表达变化,以及是否受JAML的调控。(1)Western blot检测SIRTs家族各亚型(Sirt1-7)在肾皮质中的蛋白水平变化。(2)免疫荧光双标SIRT1与足细胞标志蛋白Synaptopodin观察肾小球足细胞中SIRT1的表达变化。(3)体外实验中,用高糖(40mmol/L)刺激足细胞24h,Western blot检测Sirtl蛋白表达变化。同时,利用慢病毒转染过表达JAML检测Sirt1蛋白水平。3.2 JAML通过Sirt1调控AMPK的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是Sirt1信号通路重要的代谢整合因子,在细胞代谢和线粒体功能的调节和Sirt1有相似之处,所以我们进一步检测了 AMPK的活性。(1)Western blot检测肾皮质中p-AMPKα和AMPKα蛋白变化,验证JAML对AMPK磷酸化的调控。(2)利用JAML shRNA慢病毒转染足细胞沉默JAML,并同时转染Sirtl的小干扰RNA沉默Sirt1基因,检测高糖处理的足细胞中AMPK磷酸化的变化。3.3 JAML-Sirt1信号通路调控转录因子SREBP1及其下游靶基因的表达3.3.1利用转录组测序技术分析JAML下游信号通路安捷伦全基因组寡核苷酸测序用于分析组间差异表达基因,检测JAML基因沉默对高糖诱导的足细胞内下游基因的影响。3.3.2 JAML调控SREBP1及其下游信号通路(1)RT-qPCR验证足细胞中Srebp1,Srebp2及其下游靶基因如脂肪酸合成相关基因(Fasn,Acaca,Scd1),胆固醇合成相关基因(Sqle)的mRNA水平变化。(2)Western blot 检测肾皮质 mSREBP1,FASN,ACC1,SCD1,SQLE 的蛋白表达。(3)RT-qPCR验证肾小球中Srebp1,Srebp2的mRNA水平。(4)Western blot检测肾小球中成熟体mSREBP1的蛋白表达变化。3.4 JAML-Sirt1-AMPK信号通路调控SREBP1的表达为了明确JAML是否通过Sirt1、AMPK调控SREBP1的表达,我们同时沉默足细胞中的JAML和Sirt1或者AMPK,给予高糖刺激后,Western blot检测成熟体mSREBP1的表达变化。3.5阿霉素诱导的足细胞损伤模型中JAML对Sirt1-AMPK-SREBP1信号通路的作用。慢病毒转染JAML shRNA的足细胞系,用ADR(0.15μg/ml)处理,,Western blot检测Sirt1、p-AMPKα及mSREBP1的表达变化。研究结果第一部分:JAML在糖尿病肾病中的表达模式1.1临床病人血清和肾组织标本检测JAML的表达情况(1)ELISA检测发现与健康受试者血清样本相比,DKD患者血清中JAML水平显著升高。(2)肾活检样本免疫组织化学结果显示,DKD、FSGS、MN和MCD患者的肾小球中JAML表达显著增加。(3)DKD患者肾小球中JAML表达水平与肾脏损伤严重程度呈正相关(4)在所有伴有蛋白尿的肾小球疾病患者的肾小球中JAML表达与血肌酐呈正相关,与eGFR呈负相关,而与24小时尿蛋白无相关性。1.2糖尿病肾病动物模型中JAML的表达变化(1)ELISA结果显示,db/db小鼠和STZ/HFD诱导的DKD小鼠血清中JAML含量显著升高。(2)Western blot、RT-qPCR及免疫组化结果显示,db/db小鼠和STZ/HFD诱导的DKD小鼠肾皮质中JAML的mRNA水平及蛋白表达均显著增多,且主要集中在肾小球。(3)JAML与Synaptopodin免疫荧光共定位结果显示,db/db小鼠足细胞中JAML表达显著升高。1.3体外模拟糖尿病肾病条件检测足细胞中JAML的表达变化HG、AGE、PA、胆固醇、ox-LDL以及DKD患者血清均可诱导足细胞内JAML的表达显著升高。然而,用HG刺激肾小球内皮细胞和系膜细胞,JAML未发生明显变化。1.4局灶性节段性肾小球硬化模型中JAML的表达变化(1)Western blot及免疫组化结果显示,ADR模型第5周JAML变化不显著,而第10周表达显著增加。(2)ADR刺激足细胞,JAML mRNA及蛋白表达均升高。第二部分:JAML在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用2.1构建JAML足细胞特异性敲除小鼠的DKD模型(1)提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型,结果显示,Cre+/Jamlfl/fl即为足细胞Cre阳性且具有纯合Loxp-JAML小鼠,理论上可实现足细胞中特异性敲除JAML。(2)JAML与Synaptopodin免疫荧光双标共定位,发现足细胞中JAML表达水平显著降低。(3)免疫磁珠法分离肾小球,光学显微镜下观察具有代表性的肾小球样品纯度大于98%,肾小球样品纯度高且未被肾小管碎片污染。Western blot检测结果显示,Cre+/Jamlfl/fl小鼠肾小球中JAML蛋白表达降低,进一步证实JAML足细胞特异性敲除小鼠构建成功。2.2足细胞JAML缺失可减轻糖尿病肾病肾脏损伤2.2.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病足细胞损伤、减轻蛋白尿(1)与正常对照组小鼠相比,STZ/HFD模型小鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白显著升高,体重降低,肾重体重比增加,而心率、血压未出现显著变化。JAML足细胞特异性敲除小鼠血压、心率未出现显著变化。STZ/HFD诱导的Cre+/Jamlfl/fl小鼠的尿白蛋白排泄明显减轻。(2)在2型DKD模型中,与db/+小鼠相比,db/db小鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白显著升高,体重显著增加,而心率、血压无显著变化。而JAML足细胞特异性敲除的db/db小鼠以上生理生化指标无显著差异。从12周龄开始,db/db//Cre+/Jamlfl/fl小鼠尿蛋白显著降低,杂合基因型db/db//Cre +/Jamlfl/+小鼠尿蛋白也有所缓解。(3)DKD小鼠形态学实验显示,Cre+/Jamlfl/fl模型小鼠显著缓解肾小球系膜基质增生,基底膜增厚、足突数量减少及足突宽度增加,而杂合基因型db/db//Cre+/Jamlfl/+小鼠肾脏损伤也部分改善。(4)JAML足细胞特异性敲除小鼠显著恢复Nephrin和Podocin表达,杂合基因型小鼠db/db//Cre+/Jamlfl/+也能够部分改善Nephrin和Podocin损伤。2.2.2足细胞特异性敲除JAML可减轻肾小球炎症反应RT-qPCR检测结果表明,足细胞特异性敲除JAML可抑制STZ/HFD诱导的DKD小鼠肾小球中炎症因子IL-6、ICAM-1、MCP-1、TNF-α的表达升高。2.2.3足细胞中JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞损伤JAML基因沉默明显减轻HG诱导的足细胞中炎症因子IL-6、ICAM-1、MCP-1、TNF-α的表达;减轻足细胞死亡和改善足细胞骨架重排。2.3足细胞JAML缺失可以减轻糖尿病肾病肾小球及足细胞内的脂质沉积2.3.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病小鼠肾小球及足细胞内的脂质沉积。(1)油红O染色结果显示,足细胞特异性敲除JAML可减轻DKD小鼠肾小球中脂质沉积。(2)免疫荧光标记Adipophilin和Synaptopodin,结果表明,足细胞特异性敲除JAML可显著减少DKD小鼠的足细胞内脂质沉积。2.3.2 JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞脂质沉积(1)油红O染色和Nile Red荧光染色结果显示,HG可诱导足细胞中性脂质和脂滴增加,而JAML基因沉默可减少HG刺激下足细胞中脂质沉积。(2)脂质组学定量分析结果表明,JAML基因沉默能够降低HG诱导的足细胞内胆固醇酯(CE)、游离脂肪酸(FFA)、神经酰胺,磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)的水平。2.3.3肾小球疾病患者肾活检样本中JAML与脂滴蓄积程度的相关性分析免疫组化检测结果表明,在DKD、FSGS、MN和MCD患者肾小球中,Adipophilin的表达与JAML表达水平呈正相关。2.4 JAML在局灶性节段性肾小球硬化足细胞脂代谢紊乱中的作用(1)足细胞特异性JAML敲除能够减轻ADR模型小鼠的蛋白尿;PAS染色及TEM结果显示,足细胞特异性JAML敲除小鼠可减轻ADR诱导的肾脏损伤。(2)体外油红O染色结果显示,基因沉默JAML可以减少ADR诱导的足细胞中脂质沉积。第三部分JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢稳态失衡中的作用机制3.1足细胞内JAML调控Sirt1的表达变化(1)Western blot 结果显示,Sirt1、Sirt3、Sirt6 和 Sirt7 在 Cre+/Jaml+/+DKD小鼠肾皮质中显著降低,而Cre+/Jamlfl/fl小鼠中Sirt1的表达可明显恢复,Sirt7的表达也有部分恢复。(2)Sirt1和Synaptopodin的免疫荧光双标结果显示,STZ/HFD模型小鼠足细胞中Sirt1表达显著降低,而Cre+/Jamlfl/fl小鼠Sirt1表达明显恢复。(3)Western blot实验结果显示,足细胞中沉默JAML可恢复HG诱导的Sirt1蛋白水平降低;足细胞中过表达JAML,可抑制Sirt1的蛋白水平。3.2 JAML通过Sirt1调控AMPK的磷酸化(1)DKD小鼠模型的肾小球中p-AMPKα水平降低,而Cre+/Jamlfl/flDKD小鼠肾小球中p-AMPKα水平恢复。(2)Western blot实验验证Sirt1沉默效率,结果显示Sirt1沉默效果显著。进一步实验同时沉默JAML和Sirt1,发现HG和Sirt1基因沉默都能诱导AMPKα活性降低,而JAML沉默能够显著恢复p-AMPKα水平。3.3 JAML-Sirt1信号通路调控转录因子SREBP1及其下游靶基因的表达3.3.1利用转录组测序技术分析JAML下游信号通路通过分析转录组测序结果,我们发现足细胞内JAML的缺失可显著抑制HG诱导的转录因子Srebp1及其调控靶基因(Fasn、Acaca、Scd1和Sqle)的水平升高。3.3.2 JAML调控SREBP1及其下游信号通路(1)RT-qPCR及Western blot检测结果表明,足细胞中沉默JAML可显著降低HG诱导的Srebp1及其下游Fasn、Acaca、Scd1 和Sqle脂肪酸和胆固醇合成基因的mRNA和蛋白表达,而Srebp2虽然在HG条件下表达升高,但JAML基因沉默对其无明显作用。(2)DKD小鼠模型的肾小球中Srebp1和Srebp2的mRNA和蛋白水平均明显升高,足细胞特异性敲除JAML可抑制DKD小鼠肾小球中Srebp1的表达。3.4JAML-Sirt1-AMPK信号通路调控SREBP1的表达Western blot检测结果显示,HG处理的足细胞中沉默Sirt1或者AMPK均可抵消JAML基因缺失所引起的SREBP1表达的降低。说明JAML通过Sirt1和AMPK调控mSREBP1蛋白水平。3.5阿霉素诱导的足细胞损伤模型中JAML对Sirt1-AMPK-SREBP1信号通路的作用。Western blot实验结果显示,JAML基因沉默可恢复ADR诱导的Sirt1和p-AMPKα蛋白水平的降低,同时抑制ADR诱导的mSREBP1表达水平的升高。结论及创新性1.JAML在足细胞损伤肾病患者血清及肾脏中显著升高,相关性分析发现JAML蛋白水平与患者血肌酐呈正相关,和eGFR呈负相关。2.特异性敲除足细胞内的JAML显著抑制DKD小鼠足细胞损伤及蛋白尿生成,进一步发现基因沉默JAML可以抑制高糖诱导的足细胞脂质代谢紊乱。3.本实课题首次发现JAML通过调控Sirt1/AMPK/SREBP1信号通路作用于DKD足细胞脂代谢紊乱,为DKD的防治提供了新的治疗靶点与实验基础。4.JAML在足细胞损伤中的作用可能具有广泛意义。我们发现在阿霉素诱导的FSGS模型中,JAML在足细胞中表达升高,足细胞特异性敲除JAML可减轻足细胞损伤及脂代谢紊乱,可能也通过调节Sirt1/AMPK/SREBP1信号通路发挥作用。