γ-干扰素(IFN-γ)主要是在特定的抗原、有丝分裂原(ConA、PHA)的刺激下由活化T淋巴细胞或NK细胞产生的一类具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白。自Cerretti于1986年首次克隆出乳牛IFN-γ基因后,重组牛IFN-γ(rBoIFN-γ)先后在原核表达系统、真核表达系统、巴斯德毕赤氏酵母系统、牛I型疱疹病毒载体(BHV-1)中成功获得了表达,并对其免疫学和生物学活性进行了研究。国内外关于牛IFN-γ的研究和应用方面的工作已经开展很多,但不论是对免疫细胞功能及机体细胞免疫应答方面的研究,还是对疾病状态下IFN-γ产生水平的判定,都需要一种简便、快速的检测手段。应用牛IFN-γ单克隆抗体作为研究、检测IFN-γ的手段,在免疫机制的研究、免疫功能检测等领域具有广泛的应用。本研究通过常规PCR方法从pMD18-T-BoIFN-γ质粒中扩增出BoIFN-γ成熟蛋白基因,并将其插入原核表达载体pET30a和pGEX-6p-1中,经DNA测序确认后,分别转化入Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导分别表达出约18ku和42ku左右的融合蛋白。以纯化的rHis-BoIFN-γ蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,用纯化的rGST-BoIFN-γ蛋白做为检测抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选,共筛选出4株稳定分泌抗rBoIFN-γ的单克隆抗体的细胞株,分别命名为3C9、3D10、2C12、5C4,免疫球蛋白类均为IgM,轻链为κ链;杂交瘤细胞株连续传代15次以上及冻存后复苏,细胞生长状态良好,效价稳定;腹水效价分别为1:51200、1:51200、1:12800、1:6400。Western blot结果表明,4株单抗均可特异性的识别rGST-BoIFN-γ蛋白,而不与GST标签蛋白反应。间接ELISA试验证明,4株单抗只与rBoIFN-γ反应,而不与GST蛋白和rGoIFN-α、rGoIFN-γ、rBoIFN-α等细胞因子发生交叉反应。间接免疫荧光结果表明,4株单抗均与BHK21细胞表达的rBoIFN-γ发生强荧光信号,进一步证明了单抗的特异性。阻断ELISA检测结果表明3D10株单抗能够与天然干扰素发生反应,证实了该单抗具有实际的应用价值。本研究所制备的4株抗BoIFN-γ的单克隆抗体,为进一步研究BoIFN-γ单抗在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用奠定了基础。