柠檬醛作为一种非常重要的香精香料,在食品、日用化学品、医药等行业中都有广泛的应用。柠檬醛结构中有两个C=C和一个C=O,其双键的氢化可形成多种氢化产物。柠檬醛α,β位的C=C键经不对称还原可生成(R)-香茅醛,(R)-香茅醛是合成L-薄荷醇的关键中间体。虽然日本高砂公司通过以月桂烯为底物,经手性重金属催化剂催化合成(R)-香茅醛,但仍然存在催化剂昂贵、得率不高等问题。鉴于此,开发新的(R)-香茅醛合成工艺具有重要的学术意义和较高的应用价值。本研究以克隆、表达的重组蛋白老黄酶OYE2作为催化剂,直接以柠檬醛为底物合成香茅醛;通过偶联甲酸脱氢酶FDHCB催化的辅酶循环来提高底物浓度以及产物得率;在优化的条件下,探究了催化体系放大对香茅醛得率的影响;通过偶联氨基酸催化的柠檬醛顺反异构反应,提高(R)-香茅醛的e.e.值。此外,探索了酶的分子改造对其活力和立体选择性的影响。具体结果如下:1.本研究以酿酒酵母基因组为模板克隆得到老黄酶基因oye2,并成功构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-oye2。以纯化后的老黄酶OYE2和甲酸脱氢酶FDHCB作为催化剂构建催化体系,经优化后得到最优的体系组成如下:0.42 mg/mL OYE2、0.2 U/mL FDHCB、100 mmol/L甲酸钠、0.5 mmol/L NAD~+和50 mmol/L PIPES缓冲液(pH7.0)。在30℃和200 r/min的条件下,25 mmol/L柠檬醛经10 h还原反应,香茅醛得率为92.0%;当柠檬醛浓度提高至30 mmol/L,最终得率仍然有88.5%。2.为了构建不对称还原高浓度柠檬醛的反应体系,在10 mL反应器中分别考察了恒定pH、反应体积、底物浓度、溶剂种类等对产物得率的影响。结果表明,控制恒定pH时香茅醛得率要比对照高10.9%。以仲辛醇溶剂的效果要略好于异丙醇。在10 mL体系中,当柠檬醛浓度为50 mmol/L和100 mmol/L时,催化反应8 h,最终的香茅醛得率分别是94%和97.8%。当浓度分别提高至150 mmol/L和200 mmol/L时,香茅醛得率为80.6%和51.4%。柠檬醛氢化产物经红外光谱和核磁共振谱分析,确认为香茅醛。底物顺反柠檬醛与产物(S/R)-香茅醛均有对应关系,因而不对称氢化反应与氨基酸催化的柠檬醛顺反异构反应相偶联,从而提高产物香茅醛的e.e.值。在考察的12种氨基酸中,甘氨酸提高e.e.值最为显著,在50 mmol/L柠檬醛经不对称还原反应4 h后,香茅醛得率达到100%,且e.e.值>65%,比不偶联异构化反应时提高了约40%。3.为了进一步提高OYE2的活力和立体选择性,基于理性设计策略对OYE2进行了分子改造。通过序列和结构分析,选择了10个突变靶点,并成功获得了7个突变酶。突变酶经诱导表达、分离纯化后用于催化反应,考察其催化表现。结果表明,所有突变子的活力都不同程度下降。对于产物e.e.值,只有突变子K151H提高了15%,其余的均没有变化。此外,突变子W116F成功表达后未检测到酶活力。