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目的:随着早产儿存活率的逐渐增加,早产儿脑白质损伤的发病率也呈现逐年增加的趋势。脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia,PVL）是早产儿脑白质损伤的主要类型之一,其损伤部位及程度直接关系到早产儿神经系统功能的发育。但目前该病仍没有有效的临床治疗措施。近些年随着国内外学者对PVL研究的不断深入,人们发现星形胶质细胞活化是早产儿脑白质损伤的一个标志性特征,活化的星形胶质细胞可能不是PVL发生发展的偶然病理反应,而是PVL组织损伤修复过程中的主要参与者。星形胶质细胞在脑白质损伤情况下,可以通过抑制毒性反应的机制维持神经元周围微环境及整个脑组织的稳态,从而发挥保护神经元功能的关键作用。目前有研究表明白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）可通过白血病抑制因子受体（leukemia inhibitory factor receptor,LIFR）介导Stat3信号通路促进体外培养的星形胶质细胞存活,从而保护星形胶质细胞免受活性氧自由基损伤并促进少突胶质前体细胞发育成熟。但星形胶质细胞不同活化状态下LIFR的表达变化以及下游信号应答机制尚不明确。因此,我们推测不同LIFR表达水平可能会通过不同信号转导通路对星形胶质细胞发挥不同的生物学效应。本研究的目的旨在发现调控缺氧缺血（hypoxic ischemia,HI）致PVL损伤后星形胶质细胞功能的新机制,进而充分发挥其适度活化的保护作用,同时有效扼制其过度凋亡的负面影响,为PVL的治疗提供重要的研究基础。研究方法:1、动物实验模型与分组:本研究体内研究采用国际公认的早产儿PVL脑损伤大鼠模型。出生第3天的SD大鼠,雌雄不限。实验动物随机分成3组:（1）对照组（2）PVL组（3）PVL+LIF组。对照组32只,PVL组及PVL+LIF组各54只。对照组:将大鼠左侧颈总动脉游离但并不结扎,术后将大鼠放回原来的常氧环境中继续饲养。PVL组及PVL+LIF组:将大鼠左侧颈总动脉结扎,术后恢复1小时后,37℃条件下低氧处理（O2浓度6%-8%）120min。PVL+LIF组大鼠于术后1天开始给予腹腔注射LIF（50ug/Kg.d,日1次,连续7天）,而对照组和PVL组大鼠则于相同时间点给予腹腔注射相同剂量的无菌生理盐水。选取术后（即HI后）3d（HI 3d）、7d（HI 7d）、14d（HI 14d）、28d（HI 28d）四个时间点的鼠取脑组织。将准备做HE染色检测或免疫组化的动物组织标本浸泡于4%多聚甲醛中,固定后石蜡包埋;将准备做Western-Blot的动物组织标本放置于-80℃冰箱保存。2、细胞实验模型与分组:将原代培养传至第三代的星形胶质细胞随机分为正常培养组（N组）和氧糖剥夺培养组（oxygen glucose deprivation,OGD组）;两组细胞除了常氧培养和OGD 24h复氧（reoxygenation,R）24h培养处理不同外,还分别根据LIF干预剂量或小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）干扰与否进行不同分组。准备进行免疫组化或免疫荧光的细胞,用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）冲洗3遍后,加入4%多聚甲醛固定;用于实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q-PCR）的细胞用Trizol总RNA提取液裂解后,收集至无菌的Eppendorf管内,于-80℃冰箱保存待用;用做蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）的细胞在弃培养基之后用PBS冲洗细胞3遍,浓度为0.25%胰酶消化贴壁细胞后离心去上清,收集沉淀于无菌Eppendorf管内,保存于-80℃冰箱。3、实验方法及检测指标:（1）动物实验:利用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色方法观察各组大鼠脑白质的病理形态学变化;利用免疫组织化学染色法检测各组大鼠脑白质中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）及髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）的表达;利用GFAP免疫荧光及原位末端转移酶标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）双染检测各组大鼠脑室周围白质中星形胶质细胞凋亡水平:利用Western Blot方法检测各组大鼠脑白质中LIFR、GFAP、MBP、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein,Bax）蛋白表达;（2）细胞实验:通过GFAP免疫组化和免疫荧光方法鉴定原代星形胶质细胞;通过TUNEL染色以及流式细胞仪技术检测体外培养的星形胶质细胞凋亡情况;通过MTT法测定体外培养的星形胶质细胞活力;通过实时荧光定量PCR检测体外培养的星形胶质细胞LIF以及LIFR的相对表达量;通过Western Blot方法检测体外培养的星形胶质细胞LIFR、Cleaved-Caspase3、Bcl2、Bax、p-Akt、Akt、p-Stat3、Stat3、p-Erk1/2、Erk1/2的蛋白表达;应用Golden Transfer TM-D转染试剂将SiRNA瞬时转染至体外培养的星形胶质细胞沉默LIFR基因表达;并通过实时荧光定量PCR方法检测转染成功的星形胶质细胞LIFR的相对表达量;用Western Blot方法检测转染成功的星形胶质细胞LIFR、Bcl2、Bax、p-Akt、Akt、p-Stat3、Stat3、p-Erk1/2、Erk1/2的蛋白表达情况;结果:一、体内实验:1、HE染色结果显示:HI 3d,PVL组大鼠脑室周围白质表现为神经细胞排列紊乱且间隙增宽,脑白质结构疏松且出现筛网状坏死。HI 7d,细胞水肿明显且呈不规则排列,核固缩,脑室周围白质水肿、组织疏松,可见点状、条索状和囊状坏死。HI 14d,脑白质可见空囊形成,脑室周围白质结构模糊稀疏,神经纤维走形紊乱,细胞排列紊乱,可见胶质细胞增生。HI 28d,病理改变与HI 14d的改变相似。PVL+LIF组表现与PVL组各时间点表现相近,只是脑损伤程度相对较轻。2、GFAP免疫组化以及Western Blot结果均显示:HI 3d,PVL组及PVL+LIF组脑室周围白质内GFAP阳性细胞开始较对照组有所增多,而且PVL+LIF组增多更明显（P<0.05）。HI 7d开始,PVL组及PVL+LIF组脑室周围白质内GFAP阳性细胞仍多于对照组,但PVL+LIF组较PVL组明显减少（P<0.05）。3、MBP免疫组化以及Western Blot结果均显示:HI 7d、HI 14d及HI 28d各组大鼠胼胝体、纹状体、内囊及外囊等部位均可见阳性MBP免疫染色且阳性染色随着时间推移逐渐增强;但每个时间点PVL组手术侧相应部位MBP阳性染色均弱于对照组（P<0.05）。虽然PVL+LIF组MBP阳性染色弱于对照组,但与相应时间点的PVL组相比均增强（P<0.05）。4、Western Blot检测Bax/Bcl2表达的结果显示:HI 3d开始,各时间点PVL组及PVL+LIF组均出现不同程度神经细胞凋亡,但PVL+LIF组细胞凋亡水平较相同时间段的PVL组降低（P<0.05）。5、Western Blot检测LIFR表达的结果显示:HI 3d开始,PVL组及PVL+LIF组脑室周围白质内LIFR表达均较对照组增多,但PVL+LIF组增多更显著（P<0.01）。6、GFAP和TUNEL免疫荧光双染共定位观察星形胶质细胞凋亡水平结果显示:HI 3d开始,PVL组脑室周围白质中星形胶质细胞凋亡数量与对照组相比逐渐增高（P<0.05）。PVL+LIF组星形胶质细胞凋亡数量也较对照组增加,但与PVL组相比,PVL+LIF组星形胶质细胞凋亡数量均降低,尤其是HI后14天和28天,具有显著差异（P<0.05）。二、体外实验:1、氧糖剥夺再复氧成功诱导了星形胶质细胞的凋亡,LIFR表达增加,Bcl2表达降低、Cleaved-Caspase3表达增高、p-Akt/Akt及p-Stat3/Stat3比值表达降低而p-Erk1/2/Erk1/2比值表达增高。2、氧糖剥夺条件下给予LIF干预后的星形胶质细胞凋亡情况得到改善,尤其是LIF 30ng/ml的剂量时,抑制凋亡的效果最明显。3、氧糖剥夺条件下给予LIF干预后星形胶质细胞的LIFR表达逐渐增加,LIF 30ng/ml时LIFR表达水平达高峰。4、氧糖剥夺条件下给予LIF干预后的星形胶质细胞的Cleaved-Caspase3表达降低、Bcl2表达增高、p-Akt/Akt及p-Stat3/Stat3比值增高而p-Erk1/2/Erk1/2比值降低。5、SiRNA干扰成功抑制LIFR表达。6、SiRNA沉默LIFR表达后,氧糖剥夺条件下星形胶质细胞细胞活力显著下降;N组细胞和OGD组细胞凋亡均较未干扰组显著增加。7、OGD+SiRNA组细胞Bcl2表达水平较OGD组进一步降低,Bax表达水平较OGD组进一步增加。8、OGD+SiRNA组P-Akt/Akt、P-Stat3/Stat3比值较OGD组进一步降低。相反,OGD+SiRNA组P-Erk1/2/Erk1/2比值较OGD组进一步增高。结论:1、LIF可显著改善PVL大鼠脑白质的病理变化,具有保护PVL模型鼠大脑免受缺血缺氧导致的脑白质损伤的作用和保护髓鞘化的作用。LIF在HI后的不同时期对星形胶质细胞的活化发挥不同作用,可通过调节星形胶质细胞增殖和凋亡之间的平衡发挥保护和修复神经系统的作用。2、LIF在氧糖剥夺条件下提高星形胶质细胞的活力并抑制星形胶质细胞的凋亡。LIF通过LIFR发挥抑制星形胶质细胞凋亡的关键作用。3、LIFR通过调控Stat3、Akt以及Erk1/2等多种信号转导途径,提高Bcl2表达水平,从而发挥抑制星形胶质细胞凋亡的作用。