【摘 要】
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为了解pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组质粒的稳定性,优化质粒的提纯方案降低杂蛋白残留量使其符合《质粒DNA疫苗的工艺指导原则》（Food and drug administration,FDA）标准,提高pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组菌冻干菌体存活率,本试验通过优化质粒提取的改良碱裂解法、正交试验优化硅藻土法纯化重组基因佐剂质粒、质粒保存稳定性和使用稳定性试验,研
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目（201703D221024-3）；
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为了解pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组质粒的稳定性,优化质粒的提纯方案降低杂蛋白残留量使其符合《质粒DNA疫苗的工艺指导原则》（Food and drug administration,FDA）标准,提高pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组菌冻干菌体存活率,本试验通过优化质粒提取的改良碱裂解法、正交试验优化硅藻土法纯化重组基因佐剂质粒、质粒保存稳定性和使用稳定性试验,研究确立质粒提取纯化工艺及稳定性。采用正交试验筛选pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组大肠杆菌的最佳冻干保护剂配方,为该重组基因佐剂量化生产提供依据。研究结果表明:（1）脱脂奶（极差R10.00）、海藻糖（极差R12.31）和甘油（极差R29.74）对pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组菌冻干保护效果影响依次增高;甘油Ij值:Ij3＞Ij2＞Ij1;海藻糖Ij值:Ij3＞Ij2＞Ij1;脱脂乳Ij值:Ij2＞Ij1＞Ij3,因此最佳冻干保护剂配方为A3B3C2,即用15%海藻糖、3%甘油和10%脱脂奶组成的冻干保护剂,对pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组菌的菌体存活率可达96.15%。（2）改良碱裂解法的质粒产量显著高于CTAB法和LiCl法（P＜0.01）;改良碱裂解法中对超螺旋质粒提取量的影响由大到小依次为NaOH终浓度（极差R112.65）、菌液OD值（极差R63.90）和裂解时间（极差R41.05）,裂解时间Ij值:Ij3＞Ij2＞Ij4＞Ij1;NaOH 终浓度 Ij 值:Ij3＞Ij4＞Ij2＞Ij1;菌液 OD 值 Ij 值:Ij1＞Ij4＞Ij3＞Ij2,超螺旋质粒提取工艺中最优组合是A3B3C1,即碱裂解液Ⅱ中NaOH终浓度为0.18 moL/L,裂解时间为5 min的改良碱裂解法对OD600值为0.6的菌液进行质粒提取,此条件下可获得高产量的超螺旋质粒样品。（3）正交试验中盐酸胍、NaCl和硅藻土对质粒产量及其蛋白质残留量的影响（极差）依次降低。盐酸胍 Ij 值:Ij3＞Ij2＞Ij1;NaCl Ij 值:Ij3＞Ij2＞Ij1;硅藻土 Ij 值:Ij3＞Ij2＞Ij1,所以对质粒提取量的最优水平为A3B3C3;盐酸胍Ij值:Ij1＞Ij2＞Ij3;NaCl Ij值:Ij3＞Ij2＞Ij1;硅藻土 Ij值:Ij3＞Ij2＞Ij1,所以对杂蛋白残留量的最优水平为A1B3C1。验证试验中A3B3C1组、A2B3C1组和A1B3C1组的杂蛋白含量差异不显著（P＞0.05）,且均＜0.01 μg/μg质粒的FDA标准。A3B3C3组、A3B3C1组、A2B3C1组和A1B3C1组的质粒产量依次降低,其中A3B3C3组与A3B3C1组无显著差异（P＞0.05）,A2B3C1组与A1B3C1组无显著差异（P＞0.05）,但前两组均极显著高于后两组（P＜0.01）。因此,硅藻土法纯化质粒去除杂蛋白的最佳组合是A3B3C1,即硅藻土、盐酸胍和NaCl的浓度分别为0.1 g/mL、5 mol/L和0 mol/L时,纯化的质粒样品纯度、蛋白质残留量和内毒素含量可达1.82、0.008 μg/μg质粒和24.54 EU/mg质粒,符合FDA标准。（4）12个月内,-80℃和-20℃的TE溶液与PBS溶液保存质粒纯度、浓度以及样品pH上与保存前菌无显著差异（P＞0.05）;12个月时-80℃TE质粒溶液超螺旋比例与保存前无显著差异（P＞0.05）;-80℃ PBS质粒溶液保存9～12个月时超螺旋比例极显著低于保存前（P＜0.01）,-20℃的PBS质粒溶液在6～12个月时超螺旋比例极显著低于保存前（P＜0.01）。保存12个月时,所有保存组超螺旋比例均大于80%,且质粒经双酶切鉴定出现约900bp和约4.7kb条带,表明12个月内,该重组质粒在TE溶液和PBS溶液中均可稳定保存,且TE溶液的保存稳定性优于PBS溶液,-80℃稳定性优于-20℃。（5）25℃放置8 h时,质粒样品的纯度、浓度、pH及超螺旋比例与0h前均无显著差异（P＞0.05）,且质粒经双酶切鉴定出现约900bp和约4.7kb条带,表明该重组质粒在25℃可稳定放置至少8 h。
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