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本论文以圆弧青霉BD26(PenicilliumcyclopiumBD26)为出发菌株,采用RT-PCR扩增出编码脂肪酶的774bp成熟肽基因片段。序列测定结果表明,该序列与圆弧青霉基因序列(GenBank登录号:AF274320)和扩展青霉脂肪酶基因序列(GenBank登录号:AAG22769)同源性高达99%。
脂肪酶基因LipPD克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a、pET-25b和pTrc99a,构建重组工程菌BL21/pET-28a-LipPD、BL21/pTrc99a-LipPD和BL21/pET-25b-LipPD。三种重组菌体在固体琼脂显色平板上都形成了明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示,在三种宿主菌中都含有分子量约为27kDa的活性脂肪酶蛋白。对工程菌BL21/pTrc99a-LipPD表达条件优化结果表明:该脂肪酶在pTrc99a原核表达系统中,培养至OD600为0.8时,加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,在37℃诱导培养2h后比酶活为11.74U/mg。对工程菌BL21/pET-28a-LipPD表达条件优化结果表明:该脂肪酶在pET原核表达系统中,培养至OD600为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L,在32℃诱导培养1h比酶活达29.30U/mg。工程菌BL21/pET-25b-LipPD周质溶液经NaOH滴定法测定,比酶活为24.19U/mg。
经定点突变证明,S132、D188和H241的确为LipPD的三联体催化活性中心。LipG24C的最适反应温度仍为25℃,比酶活是20.73U/mg,为野生型的85.71%。LipA252C的最适反应温度为30℃,与原酶相比提高了5℃,比酶活为34.59U/mg,是野生型的1.43倍。
将该酶成熟肽基因片段克隆入酵母表达载体pPIC9K中,电转化毕赤酵母宿主GS115。经过抗性和表型筛选,从抗性为3.00mg/mLG418的平板上挑选15株重组工程菌GS115/pPIC9k-LipPD,在其发酵上清液中没有检测到酶活,而在其胞内检测到了脂肪酶酶活,仅为10.53U/mg。SDS-PAGE电泳显示,重组蛋白在宿主菌GS115中表达量不高。