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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌）是常见恶性肿瘤之一。化疗是肝癌治疗的重要手段。然而，化疗耐药的存在，特别是多药耐药现象（multidrug resistance, MDR）是导致肝癌化疗失败的主要原因。核转录因子红细胞系相关因子-2（nuclear factor erythroid-2-related factor2,Nrf2）是细胞内重要的抗氧化应激调控因子，调控一系列细胞保护基因的表达。目前，Nrf2已成为逆转肿瘤耐药的重要靶点之一。因此，开发以Nrf2为靶点的小分子抑制剂与抗肿瘤药联用，增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性，从而改善化疗药的治疗效果，为肿瘤协同治疗提供新途径。已发现一些黄酮类化合物是有效的Nrf2抑制剂，如表没食子儿茶素3-没食子酸酯（epigallocatechin3-gallate, EGCG）、鸦胆子苦醇和木犀草素等。那么，芹菜素（4’,5,7-trihydroxyflavone, apigenin, APG）作为一种与EGCG、鸦胆子苦醇和木犀草素等Nrf2抑制剂结构类似且同样具有抗癌潜力的天然黄酮类物质，是否也能有效抑制Nrf2通路，进而增敏肿瘤细胞逆转耐药呢？目前尚未见相关报道。为此，本研究将研究APG对肝癌耐药细胞的逆转作用，并从Nrf2通路探讨其逆转耐药的作用机制。第一部分Nrf2与肝癌阿霉素耐药相关性的研究目的：探讨肝癌中Nrf2的表达与阿霉素（doxorubicin,ADM）化疗耐药的关系。方法：免疫组化法检测Nrf2、醛酮还原酶1B10（aldo-keto reductase1B10,AKR1B10）、多药耐药相关蛋白5（multidrug resistance-associated protein5, MRP5）在肝癌组织中的表达，分析Nrf2表达与AKR1B10、MRP5表达及与肝癌临床病理学特征之间的关系，免疫蛋白印迹法检测比较Nrf2在人肝癌亲本细胞株BEL-7402细胞和ADM选择性诱导的多药耐药细胞株BEL-7402/ADM细胞中的表达差异，通过siRNA干扰Nrf2表达后，MTT法检测细胞对ADM敏感性的变化。结果：Nrf2、AKR1B10和MRP5在肝癌组织中表达水平明显高于癌周正常组织（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01），肝癌组织中AKR1B10和MRP5表达水平均与Nrf2表达水平呈显著正相关（P=0.009；P=0.016）。在肝癌中，Nrf2的表达与肿瘤分化程度（P=0.017）、TNM分期（P=0.028）、肝硬化病史（P=0.017），早期复发（P=0.016）密切相关。Nrf2在肝癌耐药细胞株BEL-7402/ADM较敏感细胞株BEL-7402中蛋白表达显著增加，且干扰Nrf2基因表达后，肝癌耐药细胞株BEL-7402/ADM对ADM的敏感性显著增强。结论：本研究表明肝癌中Nrf2的高表达可能与ADM耐药相关。第二部分芹菜素通过抑制PI3K/Akt/Nrf2通路逆转BEL-7402/ADM耐药目的：Nrf2是细胞内重要的抗氧化应激调控因子，调控一系列细胞保护基因的表达。目前，Nrf2已成为逆转肿瘤耐药的重要靶点之一。在本实验中，我们将研究APG是否可以通过抑制Nrf2通路进而逆转BEL-7402/ADM细胞耐药。方法：MTT实验检测APG对BEL-7402/ADM细胞耐药性的逆转情况。荧光显微镜和流式细胞仪检测APG对细胞内ADM浓度的影响。实时定量PCR和免疫蛋白印迹法分析APG对Nrf2通路的抑制作用。结果：在本研究中，我们发现无毒剂量的APG可明显增强BEL-7402/ADM对抗癌药的敏感性，增加细胞内ADM蓄积。机制上，APG通过抑制PI3K/Akt信号通路，进而下调Nrf2mRNA和蛋白水平，并导致Nrf2下游基因HO-1、AKR1B10和MRP5表达减少，最终逆转细胞耐药。结论：结果表明APG可通过下调PI3K/Akt/Nrf2信号通路，进而增强人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM对ADM的敏感性，逆转肿瘤耐药。第三部分芹菜素联合阿霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用目的：探讨APG联合ADM对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相关机制。方法：建立BEL-7402裸鼠皮下移植瘤动物模型，32只BEL-7402细胞株移植成功的裸鼠随机分为四组：对照组、APG组（50mg/kg）、ADM组（3mg/kg）和联合用药组（APG50mg/kg+ADM3mg/kg），每组8只。上述药物每3d腹腔注射l次，共7次，观察各组药物对肿瘤的抑制作用。给药结束后处死裸鼠，切取移植瘤组织。免疫组化法检测Ki-67蛋白表达评价肿瘤细胞增殖。TUNEL染色评价肿瘤细胞凋亡情况。免疫蛋白印迹法检测肿瘤组织Nrf2蛋白的表达。结果：与单药组相比，联合应用APG及ADM显著抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。此外，联合用药还能下调肿瘤组织Nrf2蛋白的表达。结论：本研究表明与APG或ADM单药组相比，联合用药组能更有效地抑制肝癌移植瘤生长，其机制可能与抑制肿瘤增殖活性，诱导肿瘤细胞凋亡和下调Nrf2表达有关。