【摘 要】
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miRNA是一类微小但又发挥重要功能的非编码单链RNA,长约20～24 nt。经典理论认为,miRNA在细胞质中与靶标mRNA 3’UTR结合,降解mRNA或抑制翻译,从而发挥负向调控作用,但这难以解释许多miRNA对基因表达的促进作用。越来越多的研究发现,增强子所介导的转录促进是miRNA正向调控基因表达的重要机制,这种可在细胞核内分布并、具备激活基因表达功能的miRNA被称作核内激活miRNA
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31772578和No.31802048）；
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miRNA是一类微小但又发挥重要功能的非编码单链RNA,长约20～24 nt。经典理论认为,miRNA在细胞质中与靶标mRNA 3’UTR结合,降解mRNA或抑制翻译,从而发挥负向调控作用,但这难以解释许多miRNA对基因表达的促进作用。越来越多的研究发现,增强子所介导的转录促进是miRNA正向调控基因表达的重要机制,这种可在细胞核内分布并、具备激活基因表达功能的miRNA被称作核内激活miRNA（nuclear activating miRNA,NamiRNA）。本实验室前期研究发现miR-193b-3p可通过靶向促进IGF2BP1表达,促进山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,SMSCs）增殖。为探究miR-193b-3p是否作为NamiRNA发挥功能及其作用机制,本研究以山羊SMSCs为试验材料,首先基于RNA-seq数据分析miR-193b-3p过表达（n=4）和对照组（n=4）中差异表达的mRNA,然后利用核质分离、RT-qPCR和双荧光素酶报告系统等验证miR-193b-3p是否为NamiRNA,最后采用RT-qPCR、流式细胞分析和免疫荧光染色等技术研究miR-193b-3p对SMSCs增殖和凋亡的影响。主要结果如下:1.8个测序文库总共获得489 496 104条读长为150 nt的双末端clean reads,总共产生约72.13 Gb数据。97.09%～97.37%的clean reads可以比对到山羊基因组（GCA＿001704415.1）上。在miR-193b-3p过表达和对照组的比较中,miR-193b-3p过表达组上调264个基因,下调207个基因。RT-qPCR验证了上调mRNA表达趋势。GO富集分析发现上调基因可富集到胰岛素样生长因子结合通路,预测发现miR-193b-3p与该通路家族中的IGF2BP1有结合位点。2.RT-qPCR结果表明,miR-193b-3p在山羊SMSCs核质中均有分布,且核内分布比例伴随细胞分化逐渐降低（分化0天:7.47%,分化7天:2.68%）;使用pc-DNA3.1（+）质粒成功过表达miR-193b-5p（P＜0.05）,且miR-193b-5p的上调促进了miR-193b的邻近基因PARN和靶基因IGF2BP1的表达（P＜0.01）,但miR-193b-3p表达量无显著性变化（P＞0.05）;RT-qPCR结果证实miR-193b-3p对其邻近基因（MKL2、PARN和BFAR）和靶基因IGF2BP1的表达具有促进作用（P＜0.05）;双荧光素酶报告系统发现miR-193b的基因序列具有增强子活性。这些结果证实miR-193b-3p是一个NamiRNA。3.EdU免疫荧光检测结果表明,miR-193b-3p和其靶基因IGF2BP1均可促进山羊SMSCs增殖;使用流式细胞分析发现过表达miR-193b-3p后,G2期山羊SMSCs比例上升（P＜0.01）。该结果进一步验证了miR-193b-3p能促进山羊SMSCs增殖。4.RT-qPCR检测miR-193b-3p对山羊SMSCs凋亡的影响,发现凋亡标志基因Caspase1表达量无显著性变化（P＞0.05）;TUNEL检测进一步验证了miR-193b-3p对细胞凋亡无影响。Act D试验发现miR-193b-3p可下调IGF2BP1 mRNA的稳定性。表明miR-193b-3p可能通过上调IGF2BP1促进山羊SMSCs增殖。5.miR-193b-3p在小鼠成肌细胞（C2C12）中趋向抑制IGF2BP1及自身邻近基因（MKL2、PARN和BFAR）的表达;EdU免疫荧光发现miR-193b-3p抑制C2C12增殖;流式细胞分析也表明过表达miR-193b-3p后G2期细胞比例下降。说明miR-193b-3p在不同的细胞内功能不同。以上研究表明,miR-193b-3p是一个NamiRNA,通过靶向正调控IGF2BP1促进山羊SMSCs增殖,研究结果为深入揭示miRNA在山羊骨骼肌发育过程中的分子机制提供了理论依据。
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