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转抗逆多基因欧洲黑杨是通过农杆菌介导法,利用携带抗虫基因BtCry1Ac、BtCry3A和耐盐基因mtlD、BADH的多基因植物转化载体对欧洲黑杨进行遗传转化,并获得转基因株系。本研究以此为材料,通过抗虫性检测筛选出高抗株系,对高抗株系Bt基因的分子特征进行检测,并对部分高抗株系进行了耐盐性初步鉴定,以期为抗逆杨树品种的培育奠定基础。主要研究结果如下:
(1)用苗圃中栽植的16个转基因株系1年生苗饲喂鳞翅目害虫美国白蛾幼虫和鞘翅目害虫柳蓝叶甲幼虫,初步筛选出6个高抗虫性的转基因株系1、7、9、11、12和17号,对美国白蛾和柳蓝叶甲幼虫致死率均超过90%以上。
(2)对筛选出双高抗虫性的6个转基因株系进行外源基因检测,PCR检测结果表明6个转基因株系叶片中均检测到4个外源目的基因条带,而非转基因对照则未检测到,初步证明4个外源基因均已插入到受体杨树基因组中。
(3)对筛选出的6个转基因株系进行荧光定量PCR技术检测,分析6个转基因株系叶片中2个Bt基因在生长季节不同时期的表达情况。从6月至9月,转基因株系叶片中Cry1Ac转录丰度呈下降趋势,而Cry3A基因转录丰度逐渐增高,Cry1Ac和Cry3A转录丰度呈极显著负相关。
(4)利用酶联免疫吸附法对6个转基因株系叶片Bt毒蛋白表达进行检测,转基因株系均检测到Bt毒蛋白,而对照则未检测出。从6月至10月,转基因株系叶片中Cry1Ac毒蛋白的表达量总体呈上升趋势,但在7月份略有下降;Cry3A毒蛋白的表达量从6月至10月总体呈下降趋势;但Cry3A毒蛋白表达量显著高于Cry1Ac毒蛋白的表达量,Cry1Ac毒蛋白表达量与Cry3A毒蛋白表达量呈负相关。
(5)对筛选出的6个转基因株系进行不同虫龄的饲虫试验,结果显示转基因株系对美国白蛾1-2龄幼虫的致死率在76.67%-96.67%,对3-4龄幼虫的致死率在66.67%-93.33%,对5-6龄幼虫的致死率在20.00%-88.89%,均显著高于非转基因对照;对柳蓝叶甲幼虫致死率为86.67%-100.00%,对若虫致死率在70.00%-100.00%之间,对成虫致死率在73.33%-93.33%,均显著高于非转基因对照。
(6)使用筛选出的5个转基因株系(1号、7号、9号、12号、17号)和非转基因对照的组培苗进行盆栽耐盐性检测,通过综合评价其耐盐性,对转基因与非转基因对照的耐盐性进行排序得出17号>7号>1号>CK>9号>12号。
(7)对转基因株系在盐胁迫下外源基因产物检测表明,各转基因株系在盐胁迫下2种Bt毒蛋白含量较清水下相比均有大幅度的提高,非转基因对照未检测到毒蛋白;在转基因与非转基因株系中均检测到了基因BADH和mtlD的产物甜菜碱和甘露醇,在盐胁迫下各株系甜菜碱和甘露醇含量较清水相比均有不同程度的提高,但转基因株系和非转基因对照叶片中甜菜碱和甘露醇含量差异不显著。
(1)用苗圃中栽植的16个转基因株系1年生苗饲喂鳞翅目害虫美国白蛾幼虫和鞘翅目害虫柳蓝叶甲幼虫,初步筛选出6个高抗虫性的转基因株系1、7、9、11、12和17号,对美国白蛾和柳蓝叶甲幼虫致死率均超过90%以上。
(2)对筛选出双高抗虫性的6个转基因株系进行外源基因检测,PCR检测结果表明6个转基因株系叶片中均检测到4个外源目的基因条带,而非转基因对照则未检测到,初步证明4个外源基因均已插入到受体杨树基因组中。
(3)对筛选出的6个转基因株系进行荧光定量PCR技术检测,分析6个转基因株系叶片中2个Bt基因在生长季节不同时期的表达情况。从6月至9月,转基因株系叶片中Cry1Ac转录丰度呈下降趋势,而Cry3A基因转录丰度逐渐增高,Cry1Ac和Cry3A转录丰度呈极显著负相关。
(4)利用酶联免疫吸附法对6个转基因株系叶片Bt毒蛋白表达进行检测,转基因株系均检测到Bt毒蛋白,而对照则未检测出。从6月至10月,转基因株系叶片中Cry1Ac毒蛋白的表达量总体呈上升趋势,但在7月份略有下降;Cry3A毒蛋白的表达量从6月至10月总体呈下降趋势;但Cry3A毒蛋白表达量显著高于Cry1Ac毒蛋白的表达量,Cry1Ac毒蛋白表达量与Cry3A毒蛋白表达量呈负相关。
(5)对筛选出的6个转基因株系进行不同虫龄的饲虫试验,结果显示转基因株系对美国白蛾1-2龄幼虫的致死率在76.67%-96.67%,对3-4龄幼虫的致死率在66.67%-93.33%,对5-6龄幼虫的致死率在20.00%-88.89%,均显著高于非转基因对照;对柳蓝叶甲幼虫致死率为86.67%-100.00%,对若虫致死率在70.00%-100.00%之间,对成虫致死率在73.33%-93.33%,均显著高于非转基因对照。
(6)使用筛选出的5个转基因株系(1号、7号、9号、12号、17号)和非转基因对照的组培苗进行盆栽耐盐性检测,通过综合评价其耐盐性,对转基因与非转基因对照的耐盐性进行排序得出17号>7号>1号>CK>9号>12号。
(7)对转基因株系在盐胁迫下外源基因产物检测表明,各转基因株系在盐胁迫下2种Bt毒蛋白含量较清水下相比均有大幅度的提高,非转基因对照未检测到毒蛋白;在转基因与非转基因株系中均检测到了基因BADH和mtlD的产物甜菜碱和甘露醇,在盐胁迫下各株系甜菜碱和甘露醇含量较清水相比均有不同程度的提高,但转基因株系和非转基因对照叶片中甜菜碱和甘露醇含量差异不显著。